乙型肝炎病毒(hepatitis B virus ,HBV) 感染具有明显的种属特异性,是目前知道的最小的嗜肝DNA 病毒,在易感宿主细胞内易于附着、侵入和复制,并可长期持续感染。然而,HBV 的易感宿主范围很狭窄,仅限于人、黑猩猩等灵长类动物,故很难在普通实验动物中建立疾病模型。因此,建立适合于HBV 研究、简单易得的实验模型一直是研究者们追求的目标。在过去的20 多年间,国内外学者陆续建立了多种相应的嗜肝DNA 病毒模型,但尚无一个理想的模型可准确地代表人HBV 感染的所有特征。自转基因技术出现以后,HBV 转基因小鼠的研制使HBV 研究取得了很大的发展。近年来,人2鼠嵌合模型的研究成为热点。本文将从细胞模型和动物模型两方面对模型在HBV 研究中的应用作系统综述。
HBV 感染基因及原代培养的细胞模型
细胞模型目前研究的有人肝癌细胞和HBV 感染原代培养的肝细胞两个模型。
人肝癌细胞模型有三个不同的细胞系建株:
①PLC/ PRF/ 5 细胞系,由人肝癌细胞建株,具有不产生清蛋白,不含HBV DNA 的游离分子(所有HBV DNA分子均整合到细胞DNA 中) ,只表达少量HBsAg ,不产生抗壳抗原和Dane 颗粒等特点,故此细胞系主要用于研究感染HBV 后,相关细胞因子对肝脏细胞的生物学效应,如抑制因子对肝细胞的作用[1 ] ;也可用于一些抗病毒药物的研究,如反义寡核苷酸等对HBsAg 的抑制作用[2 ] 。
②Hep G2 细胞系,是由肝胚瘤细胞的活体组织建株,通过转染HBV 全基因到肝癌细胞,具有肝细胞所特有的绝大部分功能,可分泌多种血浆蛋白和表达HBsAg 和HBeAg ,主要用于HBV DNA结构与功能、HBV 对肝细胞的作用、抗病毒药物与HBV 感染的关系等研究[3 ] 。
③Hep G2. 2. 15 细胞系,则是应用重组载体pDOL T2HBV21 转染Hep G2 细胞,可获得稳定分泌病毒蛋白和病毒颗粒的细胞克隆,这个细胞系能稳定分泌大量的HBsAg、HBeAg 和Dane 颗粒,细胞内可检到HBV DNA和RNA ,但无cccDNA。细胞中不同部分整合的分子,含有头- 尾连接的拷贝, 也含有cDNA 和单链DNA , 因此,Hep G2. 2. 15 细胞系成为应用最广泛的乙型肝炎细胞模型[4 ] 。此外, Hep G2. 2. 15 细胞系可持续长时间地维持病毒复制,经多代培养仍保持病毒复制,病毒复制水平较低,但因其可分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA 和完整的病毒颗粒,故还可用于抗HBV 感染基因治疗的研究[5 ] 。
尽管如此,Hep G2. 2. 15 细胞系仍然存在以下问题,致使其应用受到一定限制,即HBV 是整合在宿主细胞染色体上,复制方式与自然感染不同,且不能被清除;病毒复制的水平不能人为改变;病毒复制水平较低;细胞培养中不产生cccDNA。而HBV 感染原代培养的肝细胞模型是在原代正常人肝细胞培养中加入含HBV 颗粒的血清或在正常鸭肝细胞培养中加入DH2BV ,均可构建HBV 感染的原代培养肝细胞模型。Springzl等[6 ] 利用Ad2HBV 1. 3 分别感染人原代肝细胞、小鼠肝细胞、大鼠肝细胞、树鼩肝细胞、鸭肝细胞和Hep G2 细胞,应用southern、northern、western blot 等方法评价。发现该细胞系与Hep G2. 2. 15 细胞系相比,具有高效转移、表达cccDNA ,可对HBV 突变和表达进行人为调控等优点,故主要用于研究HBV 对正常人肝细胞附着、HBV 病毒早期感染过程、DHBV 外膜蛋白抗体的抗感染作用以及抗病毒药物筛选等。但是,DHBV 与HHBV 的基因结构存在差异,其结果的应用受到一定限制。
建立感染HBV 动物模型的研究现状
黑猩猩是HBV 研究最具有代表性的动物模型,因为在所有动物中,灵长类与人类具有最近的亲缘关系,而黑猩猩与人类的亲缘关系最接近。受HBV 感染的黑猩猩绝大部分出现典型急性乙肝症状,细胞免疫反应与人类相似,因此可用于进行急性乙型肝炎机体免疫和肝脏病理方面的研究;少部分形成慢性感染,又可用来研究HBV 持续感染的机制。但由于黑猩猩属濒危动物、来源困难、价格昂贵,且不易诱发重症与癌变,应用受到限制。产于我国云南、广西一带的低等小型灵长类动物2树鼩,在生理机能、生化代谢和基因组成等方面与人类具有相似性,是目前已知除黑猩猩外唯一能感染人HBV 的动物品系,而且树鼩比较能适应实验环境,因此,树鼩有望成为HBV 感染的实验小动物模型。有资料报道用人HBV 接种树鼩发现肝脏细胞内有HBV DNA 复制,血清AL T 明显升高。可见树鼩可用于研究HBV 感染机制、抗HBV 药物筛选、乙肝疫苗安全性和免疫效果评价等。然而,树鼩目前多以野生繁殖为主,捕获后短期饲养便进行实验,实验结果稳定性较差。此外,树鼩感染人HBV 后转为慢性感染的成功率尚待提高[7 ] 。
目前研究发现一些禽类和哺乳类动物都可感染HBV 。因此建立嗜肝DNA病毒动物模型倍受重视。目前研究较多的是鸭乙型肝炎病毒(DHBV) 是禽类嗜肝DNA 病毒,其核酸组成与人HBV 仅有40 %～70 %同源性,无X 开放读码框,膜蛋白基因只编码非糖基化的大、小蛋白,无中蛋白。鸭子是DHBV 的自然宿主,其自然感染方式主要为垂直传播,因此,先天性或幼年感染的雏鸭可发展为持续性DHBV 感染。国内各地采用当地成熟或雏鸭建立模型,如广州麻鸭、北京麻鸭等。尽管DHBV 进入鸭肝细胞的分子机制可能与人不尽相同,但是通过对DHBV 模型的研究,在一定程度上阐述了乙肝病毒的复制机制和共价闭合环状DNA (cccDNA) 的作用。DHBV 模型也可用来评价临床前期抗病毒药物,如核苷类似物、反义寡核苷酸等治疗效果[8 ] 。虽然鸭感染DHBV 的具体特征与人类感染HBV有一定差异,但是鸭易于孵育饲养、经济、易得,并能建立病毒持续感染和提供一个与HBV 相似的体内实验系统,因此,鸭乙型肝炎病毒模型被广泛应用。土拨鼠肝炎病毒(WHV)是哺乳类嗜肝DNA 病毒,与人HBV 基因组DNA 序列同源性高于DHBV ,约为70 %以上,且基因组结构也相似。慢性感染WHV 的土拨鼠可发展为重症肝炎和肝癌,其表现明显类似于人类感染HBV ,且仅在肝、脾中发现有WHV DNA 复制中间体和WHV RNA ,故土拨鼠适用于研究HBV 慢性感染的发病机制和抗乙肝病毒药物研究[9 ] 。但土拨鼠来源困难,我国西北地区自然存在与土拨鼠同种同属的“旱獭”,可用于构建HBV 感染的动物模型。张- 等[10 ] 的研究结果显示,新疆灰旱獭肝组织中嗜肝病毒表面抗原检出率达82.2 % ,提示可以利用我国丰富的旱獭资源建立HBV 感染的动物模型方面研究。然而,WHV 与HBV 在分类、结构和生物学功能等方面不完全相同,故WHV 动物模型在研究HBV感染机理及复制过程中的应用受到一定限制。
复制转染HBV 小鼠模型的临床意义
Chisari 等使用显微注射法首次建立了HBV 转基因小鼠模型,目前该模型可分为HBV 部分序列、全基因序列和超长序列转基因鼠模型。HBV 部分序列转基因小鼠模型只表达单一基因产物,不能产生病毒,因此不适宜用于病毒复制的研究。而屠亚军等[11 ]所建立的人HBVx 基因转基因小鼠模型,可用于研究慢性乙型肝炎患者诱发肝癌的机制及HBX的反式激活机制。HBV 全基因或超长序列转基因小鼠具有病毒DNA 复制及蛋白质合成的能力,能产生较高水平的血清HBsAg 及HBeAg ,血清中可检出HBV DNA ,认为该类模型可用于评价抗病毒药物的疗效。作为一种新策略, siRNA显示了潜在的良好的治疗效果,它通过降解与目的基因相似的双链RNA 可致靶基因沉默,针对HBV 的siRNA 可通过重组腺病毒载体有效地进入转基因小鼠的肝脏,完全抑制转基因鼠中HBV 达4 周之久,显示了siRNA 的治疗效果[12 ] 。宿主对HBV 感染产生免疫耐受,但不引发体内的免疫清除,这是HBV 感染后形成慢性化的主要机制之一。因转基因小鼠对HBV 抗原处于免疫耐受状态,还可用于研究感染慢性化的形成机理。熊一力等[13 ] 在研究树突状细胞的抗原提呈功能时,发现转基因小鼠对HBV 的抗原提呈能力低下,同时观察到小鼠的T 淋巴细胞免疫活化受到抑制,鼠肝细胞应答能力下降,由此推测树突状细胞的抗原提呈能力下降,是宿主对HBV 产生免疫耐受的关键。此外,转基因小鼠还可用于慢性HBV 携带者的免疫反应缺陷机理、HBV 持续感染中抗原提呈细胞作用规律等方面的研究。尽管HBV 转基因小鼠模型在研究HBV 感染时显示了非常好的优势,但仍存在一些缺陷: ①HBV 转基因小鼠的HBV DNA 虽完全整合到小鼠基因组上,但与HBV 自然感染人体的状态有所不同; ②转基因小鼠具有遗传不稳定性; ③鼠肝内缺乏cccDNA 病毒转录模板的形成,进入鼠肝细胞内的HBV 复制时不具有完整的生活周期,不能完全模拟出病毒在人体内的复制过程;④操作复杂、整体费用高; ⑤转基因鼠的免疫耐受状态跟人体感染HBV 后的免疫反应过程存在一定差异。研究认为,表达特定基因的转基因鼠可用来研究某些特定基因表达产物对HBV 的影响和潜在的致癌性。资料显示在S 基因过度表达的转基因小鼠中, HBsAg 大量产生,堆积在肝细胞的内质网,对肝脏产生毒性,引起慢性肝损伤、炎症、增生及转录失控,严重的可引起染色体缺失,出现肝癌[14 ] 。
为了探索X蛋白在肝癌形成中的潜在作用,制备HBVx 或WHVx 基因的转基因鼠,使X 蛋白过度表达,结果证明X 蛋白在体内可以促进病毒的复制,显著提高病毒蛋白的表达,并且肝脏内X蛋白表达程度跟肝癌产生存在相关性,这可能是X 蛋白能削弱p53 的功能所致[15 ] 。为了克服鼠类对HBV 不易感的缺陷,研究者构建了重组腺病毒和杆状病毒载体,携带具有复制能力的HBV 基因,转染培养的细胞系或原代肝细胞及给小鼠尾静脉注射, 在肝细胞内出现HBV 复制, 并检出cccDNA ,结果显示腺病毒携带外源基因进入肝脏的效率高于杆状病毒,且容易被补体系统灭活,因此,认为杆状病毒不适合用于体基因转移的研究。重组腺病毒载体与HBV 1. 3构建的Ad2HBV 1. 3 体系静脉注射小鼠后,在鼠肝细胞内检出HBV 的复制,但是由于机体的免疫系统作用,致使HBV不能长期感染,因此,腺病毒载体构建的病毒感染模型应受到一定限制[16 ] 。采取流体动力学注射法在小鼠尾静脉一次性快速高容量(1. 6ml/ 20g 小鼠) 注射质料,可以提高HBV基因的转染率。资料显示,应用流体动力学法同时注射表达HBV 的质料和针对HBV 的siRNA 能够抑制病毒的复制[17 ] 。认为流体动力学法注射导致HBV 感染的模型可以用作研究抗病毒策略。与转基因小鼠相比,该模型有两个优点: ①该模型既可用于急性HBV 感染时机体免疫应答的研究,也可用于抗病毒药物及机体自发清除病毒的机制研究;②该模型还可用研究某些变异的病毒或人工突变的病毒在体内的复制能力。
探索嵌合体HBV 复制治疗的新途径
要研究病毒早期感染阶段的机制、cccDNA 的功能、病毒的细胞间扩散感染及病毒清除,就需要能够支持HBV 感染以及复制的种属特异性肝细胞,由于体外培养的肝细胞内进行研究HBV 不能完全模拟体内复制并具有其他缺陷等。最近研究报道了一些新的模型,将已感染或未感染HBV 的人肝细胞移植到小鼠体内,作为研究HBV 感染的良好体内模型。目前研究的主要有三种模型, ①三合体小鼠模型: HBV三合体小鼠(t rimera mouse) 是由Tlan 等[18 ] 首次建立的,即通过将感染有HBV 的人肝脏组织片移植到Balb/ c (已经SCID 小鼠骨髓细胞重构免疫系统) 小鼠,约有80 %的小鼠出现病毒血症。血清中的病毒滴度比较低,维持时间仅20 天,但短期观察抗病毒的疗效还是可行的。Trimera 系统为研究HBV 的复制、治疗提供了新途径。只是该模型中植入的人肝细胞只能在有限的时间内发挥作用,致使其不能长期研究。②移植人肝细胞的免疫缺陷鼠模型:为了使植入的人肝细胞在鼠体内存活时间延长,人们探索将人肝细胞植入到免疫缺陷的小鼠肝脏构建模型。资料显示[19 ] ,在缺失RA G2的小鼠肝脏内注射含HBV 基因的永生化肝细胞,可长时间产生HBV ,鼠内病毒滴度持续5 个月之久。蒋黎等[20 ] 报道在孕鼠子宫内注射人胎肝细胞,诱导胎鼠对人肝细胞产生免疫耐受,胎鼠出生后24 h 内给新生小鼠脾脏内注射人胎肝细胞,1 周后接种含人HBV 的血清,建立针对人胎肝细胞耐受的人鼠嵌合肝动物模型,结果在鼠肝组织中能检测到CK18 、HBsAg 的表达。③uPA 转基因小鼠模型: uPA 即尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物。uPA 转基因鼠因其肝细胞能特异表达Alb2uPA 转基因,诱导携带有该基因的肝细胞凋亡,引起肝细胞特异性损伤,从而利于移植细胞在该肝脏中的长期存活。Dandri 等[21 ]将uPA 转基因鼠跟RA G22 基因缺陷鼠杂交,后代被植入旱獭肝细胞,由于RA G22 基因缺陷鼠不能表达RA G22 ,故T、B 淋巴细胞不能成熟,不具备完整的免疫功能,对外源肝细胞不排斥。因此,植入的肝细胞不断生长几乎取代整个鼠肝脏,且鼠内存在旱獭病毒的感染及复制。有报道[22 ]称人肝细胞植入2～3 周龄的UPA/ RAG22 鼠内,在鼠肝中观察到人肝细胞特有因子表达及人肝细胞和鼠肝实质间出现胆管沟通。另有实验报道,给纯合子SCID2UPA 杂交鼠植入人原代肝细胞后可以形成几乎完全的人肝细胞化的鼠肝脏。给该模型接种含HBV 血清可长达5 个月之久观察到高滴度的HBV[23 ] 。该嵌合体作为研究HBV 体内感染的小鼠模型,可反映HBV 自然感染的全过程,优于黑猩猩及其他动物模型,但不适合用于研究HBV 发病机制。
目前用于乙型肝炎相关研究的模型主要存在的问题是未能建立起在生物学分类上与人类相近,并具有感染率高,感染持续时间长,感染后肝组织或肝细胞的病理改变类似人乙型肝炎以及经济适用的研究模型。据以上所述,黑猩猩、树鼩等灵长类动物跟人类亲缘关系相近,更适合用于研究HBV 感染,但这类动物珍贵难得而应用受到限制。应用较多的还是鸭、转基因鼠和HBV 细胞模型,土拨鼠模型则在国外应用较多。但无论是非人类灵长类动物模型,还是简单易得的其他模型,作为有实验价值的HBV 感染模型,必须具备2 个条件:一是要有高水平的HBV 基因表达及复制;二是要伴有持续性病毒复制和基因表达的慢性HBV 感染。总之,建立对人HBV 易感,且具有与人感染HBV 后相同或相似的肝脏病理改变及疾病转归研究模型,将能促进人类攻克乙型肝炎的进程。
