2.2 EPO 及其衍生物对细胞凋亡的作用
中枢神经细胞在缺血再灌注损伤中主要表现为细胞凋亡, 这是由基因调控的一种程序性细胞死亡。B 细胞淋巴瘤/白血病- 2(B cell lymphomal/leukmia- 2, bcl- 2) 和B细胞相关X 蛋白( bcl- 2 associated X protein, bax) 是一组在细胞凋亡中发挥重要作用的抗/促凋亡因子, 它们可各自形成同源二聚体, 也可相互形成异源二聚体。bax/bax 二聚体的过量表达可促进凋亡的发生, bcl- 2 表达增高可抑制凋亡的发生, bcl- 2 通过与bax 形成bcl- 2/bax 异源二聚体可抑制凋亡的发生, 维持细胞的活性。体内外研究[13]显示EPO 能够抑制缺血诱导的中枢神经细胞的凋亡, 可以降低缺氧条件下凋亡的发生; 外源性EPO 能减轻因缺血所导致的脊髓细胞凋亡, 这种作用可能与下调bcl- 2 和上调bax 蛋白表达有关。也说明这种外源性EPO 可能与脑源性EPO 的保护机理类似。基于外源性EPO 与脑源性EPO 相似的神经保护机理, 外源性EPO 将可能作为一种治疗药物应用于临床。
已证实EPO 可以在缺氧时促进神经元的存活[14], EPO对缺血神经元具有很强的抗凋亡作用。在动物实验中发现大鼠在缺血前后给予EPO 能减少海马和皮层神经元的死亡[15]。Siren 等[14]对大鼠脑梗死组织切片进行末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸尾标记( terminal doxynucleotidedyl transferase- mediated dUTP nick end labeling, TUNEL) 发现, EPO 使局部缺血半影区内的阳性标记凋亡神经元明显减少, 甚至消失。Celik 等[16]报道, 正常脊髓前角运动神经元大量表达EPO- R, 静脉注射rHu- EPO可使缺血诱导的运动神经元凋亡减少, 神经功能障碍减轻。对照组( 生理盐水) 脊髓前角运动神经元可见TUNEL 标记, 而rHu- EPO 处理组则否, 表明EPO 可以阻止缺血诱导的神经元凋亡。体外实验也证明EPO 具有抗凋亡作用[14]。Morishita 等[17]将培养的鼠胚海马和皮层神经置于谷氨酸15min 后再培养24h, 发现在置于谷氨酸前8h经EPO 处理的细胞存活数增加, 而应用可溶性EPO 抗体的细胞则明显减少。王金光等[18]将30 只Sprague- Dawley( SD) 大鼠根据脊髓损伤及治疗情况分为4 组: 空白组、损伤组、治疗A 组和治疗B 组, 观察药物治疗( rHu- EPO 和β- 七叶皂甙钠) 前后大鼠的神经功能行为、红细胞、血红蛋白的变化, 发现rHu- EPO 能抑制脊髓神经细胞凋亡, 对损伤脊髓的神经功能具有保护作用, 联合应用rHu- EPO 和β- 七叶皂甙钠效果更明显。
综上, 外源性的EPO 能够明显降低脊髓运动神经细胞的损害, 其机理可能是通过调控bcl- 2/bax 表达而实现对神经细胞活性的保护作用, 但是外源性EPO 是如何与脊髓运动神经细胞发生作用, 以及通过何种信号级联途径来调控bcl- 2/bax 的表达, 进而实现对神经细胞凋亡的启动的抑制作用, 仍需进一步研究。
2.3 EPO 对血管内皮细胞的作用研究
Anagnostou等[19]的研究表明, 血管内皮细胞上有EPO受体。Carlini 等[20]研究表明, 在体外rHu- EPO 可增加神经血管的形成。吴岩等[21]研究发现, rHu- EPO 可以抑制脂多糖诱导的内皮细胞凋亡。Marti 等[22]发现, EPO 还可以促进缺血区域的血管增生, 在缺血部位建立侧支循环, 从而起到间接保护神经的作用。Bernaudin 等[23]证实在缺血后第1天病灶血管内皮细胞有EPO mRNA 表达。以上研究表明,EPO 能促进血管内皮细胞增殖和新生血管形成。脊髓损伤后有大量血管内皮细胞表达EPO- R, EPO 作为血管内皮细胞的丝裂原, 刺激内皮细胞增殖迁移, 形成血管。还可通过提高来自骨髓的循环内皮祖细胞募集, 刺激血管的新生, 增加组织内氧供, 缓解局部缺氧。
2.4 EPO 对神经干细胞和祖细胞增殖与分化的作用
EPO 可以促进祖系干细胞的生长和增殖, 提高胚胎皮质神经元的生存力, 促细胞存活并可上调神经祖细胞的增殖反应。在一些细胞群中, 如前脑神经干细胞, EPO 选择性地促进神经祖细胞的产生。和其他造血因子一样, EPO也充当着分化细胞的神经营养因子, 例如EPO 可以影响细胞的再生、分化和存活, 并诱导干细胞分化为多巴胺能神经元或星形胶质细胞[24]。有研究表明[10]在实验性自身免疫脑脊髓炎的鼠模型中给予rhuEPO 能够促进少突神经胶质细胞的增殖和髓鞘形成, 以促进神经功能恢复。
3 EPO 对中枢神经系统的保护机制
实验证明神经细胞可产生内源性EPO, 以旁分泌的方式发挥保护作用。各种原因造成的中枢神经系统( central nervous system, CNS) 损伤可促使EPO 的分泌, EPO 通过与EPO- R 结合启动信号传导通路。同样当给予外源性的EPO 后, EPO 与神经元和少突胶质细胞上的EPO- R 结合, 使受体形成二聚体, 蛋白酪氨酸激酶2( JAK2) 发生自磷酸化反应和受体活化, 激活一系列的受体后保护机制。
3.1 激活cAMP 反应元件结合蛋白(CREB) 转录途径
最新的研究表明, EPO 能够激活CREB 转录途径并增加脑源性神经营养因子的表达, 这促成了EPO 介导的神经保护作用。Sonmez 等[25]通过建立鼠脊髓局部缺血模型, 再灌注之初静脉内给一定剂量的rHu- EPO, 发现EPO能够加速运动缺陷恢复, 阻止短暂性局部缺血后脊髓中运动神经元的死亡。其机制是脊髓缺血性损伤诱导脊髓前角中pCREB 的磷酸化, 而EPO 能明显促进脊髓前角中pCREB的表达。
3.2 抑制兴奋性氨基酸的毒性作用
兴奋性氨基酸在各种脑损伤, 特别是缺血性脑损伤的发病机制中起重要作用。Kawakami 等[26]研究发现, EPO能使钙离子诱导培养的小脑粒细胞神经元的谷氨酸释放受抑制, 使神经元的死亡减轻; EPO- R 的合成肽拮抗剂EMP1( EPO mimeticpeptide 1) 可通过抑制谷氨酸的胞吐作用而产生类似效应。由于EPO 和EMP1 都可激活与EPO- R 相连的酪氨酸激酶Janus 激酶2( Jak2) 。因此推测EPO 减少神经元死亡的作用是通过激活EPO- R 和Jak2,从而抑制谷氨酸释放这一机制实现的。
3.3 激活酪氨酸激酶Janus 激酶2( Jak2)
Jak2 在EPO 的信号传导中起着关键的作用。Parganas 等[27]发现Jak2 基因缺陷小鼠因红细胞生成障碍而死于胚胎期, 即使应用EPO 也不能改变结局。目前认为Jak2 先与EPO- R 结合, EPO 与EPO- R 结合后造成EPOR二聚化, 导致Jak2 与EPO- R 的结合亲和力提高, 自身激活位点被磷酸化而自我激活。激活的Jak2 引发了酪氨酸磷酸化瀑布, 使EPO- R 的酪氨酸残基和胞浆内多个蛋白如磷酸酰肌醇- 3- 激酶( P13K) 、信号转导子和转录活化子5( STAT5) 、Shpl 等酸磷酸化而相继被激活, 产生一系列效应。
3.4 其他相关机制
①激活磷酯酰肌醇- 3 激酶( phosphoinstide3- kinae,P13K) 后激活蛋白激酶B( PKB, 又称Akt) , PKB 介导多种生物学效应, 是最重要的抗凋亡调节因子; ②激活信号传导和转录活化因子( STAT) , STAT 在细胞生存和增殖方面起着重要的媒介作用。虽然Jak2/STAT5 通路大部分研究集中在红系祖细胞中, 但近来的研究表明该通路也存在于CNS。故Jak2/STAT5 通路也可能参与了神经细胞的缺血性保护; ③钙离子内流及EPO- R 的负调节机制都可能参与了EPO 对CNS 的保护作用。EPO 可能通过蛋白酪氨酸磷酸酶( protein tyrosine, PTP) 和细胞因子信号抑制因子族成员CIS( cytokine inducible SH2- containing protein) 发挥负调节作用[28]; ④上调消耗氧自由基的酶, 或下调消耗能量的酶, 保护脊髓组织免受缺氧损伤, 从而减少神经元和少突胶质细胞的丢失。另外, 在CNS 损伤后EPO 信号传导中, 还可能激活了Ras/MAKS 通路, 但该通路在脑保护中起何种作用仍不明确。
总之, EPO 及其衍生物的神经营养和神经保护功能正日益引起人们的高度重视, 尤其为脊髓损伤患者的康复治疗带来了新的希望。但诸多问题有待进一步研究, 如内源性EPO 的表达规律、外源性EPO 的治疗时间窗和量效关系以及如何早期安全有效地进行临床应用等。
