金海兰综述, 张海明曹谊林审校( 中国医学科学院整形外科医院北京医科整形美容门诊部北京100144)

干细胞是指未成熟细胞，具有自我更新和分化能力，可分化为胚胎干细胞和成体干细胞、其他细胞、组织及器官[1] ，胚胎干细胞是最有应用价值的干细胞，但由于来源于胚胎，进行相关研究和治疗必然涉及伦理和道德问题,所以胚胎干细胞的研究受到限制，而来源于同体的成体干细胞就不存在这种限制。皮肤组织更新速度快、再生能力强，因此，来自皮肤局部的干细胞受到了重视。研究表明，毛囊干细胞( hairfollicle stem cells ,FSC)能分化成毛囊、皮脂腺、表皮，是皮肤组织工程理想的种子细胞，已成为目前的研究热点。现就毛囊干细胞及其分离与识别方法的研究进展综述如下。

1 毛囊的解剖特点

毛囊是表皮向真皮中凹陷后形成的特殊结构,位于毛发下段。毛囊内外由上皮性毛根鞘和毛囊周围鞘两部分组成,两者之间有玻璃膜。它包围着毛根,上面附有立毛肌,亦与皮脂腺相连，其最外层被毛囊周围鞘围绕。上皮性毛根鞘起源于表皮, 又分内根鞘和外根鞘。外根鞘相当于表皮的基底层和棘细胞层。毛囊可分为上下两部, 上部也称为恒定部即毛囊的上段,可再分为漏斗部和峡部，在峡部末端外毛根鞘细胞增殖,并且形成隆突区(bulge), 成为毛发上段的标记。该隆突部位可环绕整个峡部末端或仅限于单侧即立毛肌附着处, 目前被认为是毛囊干细胞存在的主要部位。在毛囊的周期性生长过程中,这部分保持稳定,不发生凋亡和再生。下部也称为循环部，可再分为球部和茎部,包括隆突部以下的毛囊和毛球。在毛囊的周期性生长过程中,这部分呈现出生长、衰退、静息和脱落的形态变化。根据循环部的变化,毛发再生过程中[2],毛囊依次经历生长期、退化期、静止期及脱落期，完成一个生长周期,毛囊周期生长是由毛囊干细胞和间质细胞的共同作用完成的。

2 毛囊干细胞的定位

目前普遍认为毛囊干细胞定位于毛囊上段的隆突区。1990 年，Cotsarelis 等[3]采用连续[3H]-T 标记发现小鼠皮肤、睫毛、触须的毛囊球部并未见标记细胞及干细胞指征,但在隆突区可见,相反应用脉冲[3H]-T 标记则发现标记物布满毛母质, 而隆突区未见, 于是提出“隆突激活假说”(bulgeactivation hypothesis) 。此后,Taylor 等[4]采用BrdU 和[3H]-T 双标记方法亦证实毛囊干细胞定位于上段的隆突区。在体外培养实验中,将生长期小鼠毛囊横切成四部分进行分段培养, 发现95%的克隆形成细胞来自于含有隆突区的片段,其余少数克隆来自于毛球部[5]；培养人毛囊细胞,亦发现克隆形成细胞主要出现在外根鞘中段,近似于立毛肌附着点[6]。尽管越来越多的人赞同决定毛囊下段周期性生长的干细胞定位于隆突区,然而利用干细胞慢周期特性和毛囊生长周期特点对人毛囊进行体外分析,结果发现人毛囊干细胞在胚胎期定位于隆突区,而在成人则定位于毛囊下段- 隆突区以下的外根鞘中[7]。应用毛囊干细胞特征标记物角蛋白19(keratin 19,K19) 进行检测亦可见阳性细胞出现在隆突区和毛囊下段两个区域[8],这意味着毛囊中可能有两个干细胞储存库,或者是在个体发育过程中早期细胞发生了下移的结果。此外，不同物种或同一物种的不同部位毛囊干细胞的定位都有所不同，如在手足部位,这些干细胞存在于表皮网状嵴的深层,而在头皮部位则定位浅表或位于表皮嵴的顶部及立毛肌附着的毛囊隆突区[9]。因此人类毛囊干细胞的确切定位尚有争论, 这妨碍了人们理解毛囊干细胞在上皮生物学、创伤愈合以及肿瘤发生中的作用。

3 毛囊干细胞的分离及纯化

许多研究者采用不同的方法试图将毛囊干细胞分离出来,以进行更深入的研究，目前对毛囊干细胞分离及纯化有以下几种方法：

3.1 荧光标记细胞激活技术也称为流式细胞仪分选：这种方法可将带有一种或几种荧光标记的细胞分选出来, 原理科学,操作方便,被众多研究者采用。2004 年，Fuchs 等[10]利用该技术从毛囊隆突部纯化出了毛囊干细胞,这种方法的优点是准确,但标记细胞体外培养活力不好,不容易传代培养。

3.2 应用酶消化法[11]：将皮肤样本剪成小条, 分离酶（dispase） 低温消化后镜下切取毛囊隆突部, 置于胰酶中37℃消化后1000r/min 离心收集细胞加无血清的DMEM 条件培养液培养，每3 天换液。消化法分离的毛囊干细胞纯度较高，细胞分布均匀,细胞克隆形成能力强,增殖迅速被普遍应用于毛囊干细胞的初步分离，但获得的干细胞经历倍增期后,生长速度减慢,进入平台期，其原因可能是酶消化破坏了干细胞与微环境的联系；有研究表明[12]，在应用分离酶消化的过程中37℃消化2h，较以往4℃消化12h 缩短了消化时间，能避免干细胞损伤。

3.3 组织块法分离毛囊隆突部干细胞[13-14]：将皮肤切成0.2cm×0.2cm 大小的小块, 按表皮面朝上贴于玻璃平皿中,每皿3～4 块,加适量培养液，氢化可的松+ 青链霉素100U/ mL,置于CO2 培养箱(5%CO2,饱和湿度,37℃)中培养,每两天换液一次。组织块法分离得到的毛干细胞纯度低于消化法，细胞生长比率低,细胞不易融合。但获得的干细胞历代倍增后仍处于增殖态势，其原因可能是从组织块中迁移出来其他种类的细胞可为干细胞营造一个类似于体内的微环境,使干细胞受到的损害小。

3.4 差速贴壁法纯化毛囊干细胞[15-16]：应用酶消化法分离得到细胞后离心收集细胞接种于IV 型胶原包被的培养皿中。收集上层未贴附角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一皿中培养, 培养液为20%血清的DMEM ,每2 天换液,收集条件培养基。贴附皿底的毛囊干细胞加无血清的DMEM 条件培养液培养，每3 天换液。克隆形成试验证实分离出来的干细胞纯度大于90% ,克隆形成能力最强的细胞粘附到Ⅳ型胶原等细胞外基质的速度最快[17]。此法将酶消化法得到的细胞进一步纯化，得到纯度高的毛囊干细胞，目前被普遍应用。

3.5 显微分离技术分离纯化毛囊干细胞[18]:将皮肤样品置入分离酶中4℃消化。从脂肪端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，体视显微镜下切取毛囊隆突部，含双抗磷酸盐缓冲液漂洗3 次，加入DMEM/F12 补充培养基于37℃、5%CO2 孵箱中培养，每3 天换液。此法利用解剖学获取毛囊干细胞富集区对毛囊干细胞进行分离。但获得的毛囊干细胞纯度不高。

3.6 联用显微分离培养与免疫磁珠法[19]：显微分离培养获得毛囊隆突区细胞，应用免疫磁珠纯化毛囊隆突区细胞中CD200 阳性的毛囊干细胞可获得高纯度毛囊干细胞，且细胞活性不受影响。1990 年，Morris 等[20]应用密度梯度离心方法分离小鼠表皮干细胞。因为用这种方法不能得到高纯度的干细胞,后来很少有人再采用这种方法。