4 毛囊干细胞的识别

4.1 毛囊干细胞的组织学形态特征：毛囊干细胞在光镜下呈立方形,细胞体积小,核浆比大,表面光滑,皱折少,又被称为非锯齿形细胞,细胞体积的增大与增殖能力呈负相关。超微结构显示胞内含有大量游离核糖体而缺乏角蛋白纤维,细胞表面有少许微绒毛,细胞核存在许多卷曲,染色质弥散分布,明显不同于周围的细胞,这些形态特征均表现出原始细胞的特性。倒置显微镜下观察可见培养早期的细胞呈圆形,折光性强,表现为铺路石状；细胞大小一致,核大而明显,多偏居于细胞一侧,可见双核细胞及分裂相细胞。细胞之间连接紧密,明显分层,随后增殖的细胞亦表现相同的形态。培养2 周后,远离组织的细胞形态发生改变,逐渐伸长呈椭圆形,继续培养可见细胞皱缩,胞浆内出现黑色颗粒及细小空泡,细胞折光性降低,并有细胞裂解、死亡。

4.2 标记滞留细胞：毛囊干细胞最重要的特点之一就是慢周期性,而且可以有无限多次细胞周期[2]。当暴露于带有其他标记的核苷酸例如[3H]-T 或BrdU 时,细胞在DNA 合成的过程中摄取标记核苷酸而将标记整合于DNA 中。4～8 周后快速分裂的短暂增殖细胞(transit amplifying cells,TAC)丢失了大量标记,而由于干细胞的细胞周期长,这样的标记可以维持相当长的一段时间, 因此有人称它为标记滞留细胞(label-retaining cell,LRC),是迄今为止识别毛囊干细胞最可靠的方法之一。这种方法由Bickenbach[21]1981 年首先提出,现已成为公认的识别毛囊干细胞的方法,并被当作探索新的识别方法的参照标准。

4.3 细胞克隆形成率：毛囊干细胞是毛发中的原始细胞,其分化经[22] 毛囊干细胞、TAC 和有丝分裂后分化细胞(postmitotic differentiating cells,PDC) 三个阶段[17]。用克隆形成能力来鉴别毛囊干细胞,大而活跃生长的克隆是干细胞形成的,仅分裂很少次数就进入终末分化的细胞被认为是TAC。细胞的集聚是由于其低运动性, 反映了干细胞较TAC 更大的细胞间粘附力,是整合素高水平表达的结果。

4.4 毛囊干细胞标记物：为了对毛囊干细胞进行体外研究，寻找特异的干细胞标记物对干细胞分离培养尤为重要，毛囊干细胞尚无特定的表面标记物。目前已知高表达的分子有K15、K19、整合素、CD200 及CD34 等[23]，K19 一般认为毛囊的隆突部干细胞及胎儿、新生儿表皮基底层干细胞均表达K19, 成人无毛发皮肤如手掌、脚掌部位基底层的干细胞K19 表达阳性,但有毛发皮肤基底层中的表皮干细胞K19 表达为阴性而毛囊隆突部细胞K19 表达为阳性,与LRC 位置一致。双重标记研究证实,隆突部中K19 阳性细胞是LRC,具有干细胞的慢周期性，但K19 是否能标记全部表皮干细胞仍有待进一步研究[24]。毛囊隆突部中K15 阳性细胞亦为LRC,并且表达整和素的水平明显高于毛囊外根鞘周围细胞。进一步研究发现,在毛囊干细胞分化过程中,K15 表达减少较K19 出现更早, 据此推断K15 表达量下降可能是细胞向TAC 分化的最早征象之一,K15 阴性而K19 阳性的细胞可能是“早期”TAC, 提示K15 可能较K19 在鉴别毛囊干细胞更有意义[25]。β1 整合素表达于表皮基底层和毛囊隆突部。在人类的表皮,β1 整合素的高水平表达是毛囊干细胞的标记，但并非所有的β1 整合素阳性细胞都是干细胞,TAC 也有表达。p63 被认为是毛囊干细胞的标志之一。p63 是肿瘤抑制因子之一,是p53 的同族体,结构和功能与之类似。Pellegrini 等[26]发现在角膜缘的基底细胞有p63 表达,而在角膜表面的TAC 没有p63 表达,因而认为p63 是表皮干细胞的标志物，但p63 在毛发基质中亦有表达。CD34 是造血干细胞特异性标记物,最近研究发现其在隆突部高表达[27], 在鼠毛囊中检测发现CD34 与LRC 和K15阳性细胞在毛囊处位置一致。Trempus 提出CD34 可能是鼠毛囊干细胞最特异的标记物[28]，尽管CD34 也在真皮细胞中表达，但CD34 是细胞表面蛋白，应用抗CD34 抗体标记可通过荧光激活细胞分类法收集活性隆突部细胞，但有研究表明在人毛囊隆突部中发现其表达下降或缺失,而CD200 阳性细胞表现出更高的克隆形成率[29]，在鼠毛囊外根鞘细胞中也有CD200 表达[30]。CD200 是一种I 型膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族, 受体表达在巨噬细胞表面及T 细胞亚群上[31]。

CD200 与CD200 受体间的相互作用可以传递抑制性信号减低髓样细胞的活性,改变其迁移,在免疫疾病和抑制排斥反应中作为一种免疫耐受信号[32], 提示未来几年对于人毛囊及毛囊干细胞的免疫研究将成为新的热点[33]。单克隆抗体C8/144B,最初用于抗T 细胞蛋白CD8 的羧基末端肽,可选择性地表达于毛囊隆突部的角质形成细胞及淋巴细胞亚群。在C8/144B 染色阳性部位,β1 整合素、K15 和K19 均阳性表达，故单克隆抗体C8/144B 被认为是识别毛囊干细胞的一个标记物[34]。单克隆抗体H4 仅表达于毛囊隆突部，亦被认为是毛囊干细胞的标记物之一。在分离纯化毛囊干细胞前加入以上标记物的相应抗体并染色，分离纯化后应用免疫细胞化学、免疫组织化学、原位杂交、荧光标记识别及同焦点显微镜检测法已成为对毛囊干细胞进行识别鉴定的主要方法。

4.5 RT-PCR 检测技术的应用[12，35]：抽提分离得到细胞总的mRNA，进行RT-PCR 反应，在特定的条件下对毛囊干细胞的标记物如K15、K19 等进行逆转录，所得产物电泳条带与Marker

条带位置进行比较,判断细胞内标记物的含量。此方法也可对体外培养干细胞传代情况的判断。

对毛囊干细胞的识别目前没有公认的特异的方法，因此需要联合应用以上方法对分离纯化的毛囊干细胞进行识别并对毛囊干细胞体外传代情况进行检测。