3　分子生物学核酸检测

3.1　原位杂交( insite hyrization)指应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的H IV病毒靶核酸,最初为放射性标记,后来逐渐发展为酶标记或化学发光试剂标记。阳性率较PCR稍低,随着核酸扩增技术的出现,基因探针技术也失去了其应用价值。

3.2　聚合酶链反应( PCR)技术的一种以核酸生物学为基础的分子生物学诊断技术自1985年问世来,已成为生物医学领域最有价值的研究手段之一[ 8 ]。运用PCR 技术对于阐明H IV的发病机制有极大价值,特别适用于新生儿感染的诊断。

目前有两种方法用于H IV感染的检查:

3.2.1　PCR2DNA用于扩增前病毒DNA以诊断H IV感染。

3.2.2　PCR2RNA　用逆转录PCR ( PT2PCR)法可检测出血浆中H IV基因组的存在。

3.3　定量PCR检测病毒载量　H IV病毒载量指体内病毒复制的数量,一般以血浆H IV RNA 的拷贝数表示;病毒载量定量检测具有十分重要的临床意义, Tetali等通过测定H IVRNA的浓度发现血浆中病毒载量度与疾病进展和存活率通过bDNA和流式细胞仪进行检测,发现血浆中病载量与CD4 T淋巴细胞存在明显关系,呈负相关趋势,完全可作为H IV感染者观察疾病病变的有效指标,尤其是H IV病毒载量更具敏感性[ 10 ]。目前主要有4 种病毒载量定量PCR方法: bDNA、RT2PCR、NASBA及实时荧光定量PCR检测技术。

3.3.1　bDNA是一种核酸检测技术。它属于信号扩增,而RT2PCR及NASBA检测属于靶扩增。bDNA检测中靶探针是与H IV基因组中的pol基因序列特异结合,此段序所有已知的H IV基因组中最保守的区域。RT2PCR检测是通过逆转录(RT)及扩增( PCR)完成特异扩增H IVgag基因的一点长为142 bp的基因序列。由于每个样本中QS的量已知,运用公式算出H IV2RNA 拷贝数从而达到H IV2RNA 定量。NASBA检测是通过核酸释放提取(固有提取) 、核酸扩增(NASBA扩增)及核酸检测( ECL)检测来完成对血浆血清中H IV 病毒RNA的定量。PT2PCA,NASBA属于PCA方法,其中包括抽提RNA的步骤,所以比较受污染而使RNA 降解的bDNA RT2PCR,N ASBA有较好的稳定性、线性和可重复性。薛以乐等通过实验比较bDNA与NASBA两处方法发现在检测H IV病毒载量时具有高度一致性能, NASBA法H IRNA低浓度时敏感更高, bDNA法则能测得更广泛的亚型标本[ 4 ]。

3.3.2　实时荧光定量PCR检测技术其原理是　使用荧光基团标记探针, 5 ’端标记荧光基团, 3 ’端标记淬灭基团,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板结合的位置位于上下游引物之间,利用Taq酶的5’23’外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团的分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到,一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。上述荧光探针,称为TaqMan探针[ 13 ] 。荧光实时PCR检测技术的应用,改变了传统的电泳终点检测,可以进行实时监控,得到非常漂亮的S型扩增曲线。不但可以进行定性检测,更重要的是可以进行定量检测。样品中待测的DNA 或RNA 越高,则S型扩增曲线出现的越早,若有已知拷贝数的标准品,则可以得到未知样品的拷贝数。

3.4　基因芯片应用于H IV检测得到迅速发展人类免疫缺陷病毒(H IV) 　PRT440也广泛用于H IV21病毒的测序、分型及多态性分析[ 1 ]。但由于该技术较为复杂,且成本高,目前对其应用仍大多停留在实验阶段,离临床检验及疾病诊断的普及性还有一段距离。

4　病毒分离培养

取新鲜分离的正常人淋巴细胞,用PHA刺激并培养3～4d,接种患者单个核细胞、骨髓细胞、血浆或脑脊液等标本进行培养。培养过程中需定期换液和补加经PHA处理的新鲜正常人淋巴细胞。培养2～4周后,如有病毒生长,则出现不同程度的细胞病变。最明显是出现融合的多核巨细胞。细胞病变出现后,可用间接免疫荧光法检测培养细胞中病毒抗原,或用生化方法检测培养液中的逆转录酶活性, 以确定H IV存在[ 6 ]。

5　CD4 T胞计数

目前最常用的方法是仪器法(流式细胞仪检测) 。H IV感染人体后的主要靶细胞是CD4 淋巴细胞(也累及其他细胞) 。一般认为在疾病早期CD4 淋巴细胞> 015 ×109 /L,中期为(012～015) ×109 /L,晚期则为( 0105～012) ×109 /L,而终期可为< 0105 ×109 /L[ 2 ] 。曾惠云等[ 12 ]认为, CD4 < 100 /ul细胞是病情进展或恶化的重要标志。鲍作义等[ 11 ]研究的结果显示,当CD4 T细胞数降到200个/mm3以下时,血液中病毒载量呈10倍增长。

综上所述,各种实验方法可以根据H IV感染的不同时期与状态选择不同的检测手段。H IV原发感染2周内,任何方法均无法检测到病毒, 2周后出现病毒血症时,可检测病毒抗原,感染6～8周后可以选择检测抗体的方法。运用PCR技术可用来追踪H IV的自然感染史;可用来监测长期潜伏期(4～7年)患者;以及在抗病毒治疗期间的病毒载量水平;也可用于H IV2I血清阳性母亲的婴儿的H IV检测。在婴儿出生后最初6～9个月,他们的血清中存在母体的抗体,因此用PCR可判定婴儿是否真正被H IV感染。就目前而言,标准的检测方法是血清学H IV抗体检测,它是诊断艾滋病感染者和艾滋病的主要指标和标准检测项目;分子生物芯片等更新检测技术可能会广泛应用于临床H IV检测,会有更多的新技术被应用到这一领域。H IV的实验室检测正朝着敏感、准确、快速、自动化方向发展,我们可以用更灵敏、准确、快速的方法对H IV感染作出诊断。

参　考　文　献

1　刘彦华,仝文斌. 生物芯片技术及其应用前景. 中华医学检验杂志,2000, 3: 1772199.

2　方惠,薛以乐. H IV感染者病毒载量和CD4 淋巴细胞的意义. 上海预防医学, 2001, (7) : 2032305.

3　李敬云. H IV诊断试剂的发展. 中国艾滋病性病防治, 2001, 7 ( 1) :54256.

4　薛以乐,郑小虹. H IV病毒载量定量测定方法的比较研究. 伤害预防医学, 2001, 13 (7) : 3062307, 312.

5　魏民,邵一鸣. H IV实验室检测研究进展和发展趋势. 国外医学病毒学分册, 2003, 10 (3) : 65269.

6　张卓然,倪语星. 临床微生物学和微生物检验. 人民卫生出版社,2003: 4022405.

7　Bernard M, Branson, MD. Rap id Test for H IV Antiboby. A IDS Re2views, 2000, 2: 76283.

8　Baumforth KR,Nelso PN, Digby JE, et al. Demystified. . . the polymer2ase chain reaction. Mol patho1, 1999, 55: 1210.

9　Sp iebrg F, Kabeya CM, R yder RW, et al. Fieldt estinga ndc omparativeevalution of rap id, visually read screening assays for antibody to humanimmunodeficienyv irus. Lancet, 1989, 1: 5802584.

10　Tettale S,Bakshi S, Than S, et al. p lasma virus load evauation in rela2tion to disease p rogression in H IV2infected children. Aids Res Hum2Retrorir, 1998, 14: 5712577.

11　鲍作义,李林,庄道民,等. H IV感染者CD4 /CD8 细胞与病毒载量的关系. 中国公共卫生, 2003, 19 (11) : 138021381.

12　曹惠云,黄世敬,黄霞珍,等. T淋巴细胞亚群与人A IDS存活时间的关系探讨. 中国艾滋病性病, 2004, 10 (3) : 1692171.

13　郑晓丽. H IV 检测研究进展与发展趋势. 现代检验医学杂志,2004, 19 (6) : 64267.

14　岑柳仙. H IV 实验室检测概况. 中国艾滋病性病, 2006, 12 ( 2 ) :1922193.