Survivin在糖尿病大鼠视网膜组织的表达

www.yongyao.net　　2009-4-10 17:33:19　　来源：　　责任编辑：

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康　健　冯　闯　马晓峰　刘学政
辽宁医学院解剖教研室,辽宁省锦州市　121001

摘要　目的:研究凋亡抑制蛋白Survivin在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达水平的变化。方法:选择健康成年Spra-gue-Dawley( SD)大鼠15只,随机分成正常对照组(CON)、糖尿病3个月组(DM3)及糖尿病6个月组(DM6)。腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)诱发大鼠糖尿病。各组大鼠到期后,测定果糖胺含量。取视网膜组织使用免疫印迹(WesternBlotting)测定Survivin的表达含量,对结果进行分析。结果:DM组果糖胺含量明显增高。正常组未见Survivin表达,在DM3、DM6组均有表达,且随病程进展,其表达强度有增加的趋势,但两组间表达无显著性差异。结论:糖尿病视网膜组织中Survivin的表达上调,表达的水平并没有随着病程进展而提高。

目前,我国糖尿病患者有增多的趋势,糖尿病并发视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)按病理分类可分为增殖型(PDR)和非增殖型(NPDR),其中PDR比例约为60%,PDR患者5年后的致盲率约为50%。PDR呈逐渐上升趋势并成为成人致盲的重要因素,因此越来越引起有关学者的重视。上个世纪形成的糖基化终产物、自由基和氧化应激等都不能完整解释糖网病病理发生过程。研究发现,糖尿病动物视网膜毛细血管细胞和神经细胞存在凋亡,特异性的病理改变为视网膜毛细血管周细胞的丢失。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apop-tosis proteins, IAP)家族新成员,是一种结构独特的IAP家族成员分子,蛋白含142个氨基酸,分子量为16.5kDa,只有单一的BIR功能区和Ring结构[1]。Survivin具有肿瘤特异性,只表达于肿瘤和胚胎组织,且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关[2]。最近研究表明,Survivin与某些眼病相关。

1　材料和方法

1.1　动物分组及糖尿病动物模型的制备　选鼠龄2个月,体重为220~250g的健康雄性SD大鼠15只(辽宁医学院实验动物中心提供)。随机分成正常对照组(CON)、糖尿病3个月组(DM3)及糖尿病6个月(DM6)组,每组5只。动物喂养于该中心的标准化饲养房。铁笼喂养,不限制食水。DM3、DM6组适应性饲养2d,隔夜禁食后,用0.5mmol/L的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH= 4.5)配制成的2%STZ(STZ,Merck公司)溶液,按55mg/kg体重,尾静脉一次性注射。注射后48~72h检测定性尿糖和血糖。尿糖(+ + +) ~ (+ + + +)、血糖>16·5mmol/L者为糖尿病大鼠。成模后每周监测1次定性尿糖、体重和饮水量,每月检测一次血糖。

1.2　检测Survivin蛋白表达　各组大鼠动物到期后,10%水合氯醛麻醉处死取双侧视网膜组织,采用Western Blotting法提取组织和细胞内蛋白质样品,Bradford法测定浓度,在120g/L SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离后,电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜在含50g/L脱脂奶粉的TTBS缓冲液中37℃封闭90min,依次加入一抗(抗鼠Survivin抗体,Cell Signaling Technology抗体的稀释度为1:1 000)4℃孵育过夜,二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,抗体稀释度为1∶1 000)37℃作用40 min,TTBS充分漂洗(10min×3次)后,化学荧光法(ECL)显色,观察结果。

2　结果

2.1　大鼠一般状态　饲养过程中,DM两组大鼠饮水量及尿量明显增加,体重增长缓慢,并伴有不同程度的精神萎靡,皮毛稀疏无光泽,晶状体混浊。
CON组大鼠精神状态良好,DM两组与CON组大鼠体重、饮水量比较差异具有高度显著性(P<0·01)。见表1。

表1　各组大鼠一般状态(x±s)

组别鼠数(n) 体重(g) 24h饮水量(ml)

CON 5 350±21.9 25±4

DM3 5 239±20.1* 100±21*

DM6 5 259±15.1* 91±22*

注:与CON组比较*P<0.01。

2.2　大鼠血糖、果糖胺含量的变化　大鼠注射STZ后,血糖明显增高,并且在实验过程中始终在高水平波动。与CON组比较,DM组血糖明显增高,差异具有高度显著性(P<0.01); DM组果糖胺含量升高,与CON组比较差异具有高度显著性(P<0.01),见表2。

表2　各组大鼠血糖、果糖胺水平(x±s)

组别鼠数(n) 血糖(mmol/L) 果糖胺(mmol /L)

CON 5 3.99±0.76 2.25±0.31