3.2.3.1 体外肝细胞蛋白质组学研究体外培养的肿瘤细胞株是国内外生物学和医学研究者常用的实验模型。利用体外培养的肿瘤细胞研究原癌基因和抑癌基因，肿瘤的发生机制，转移途径和信号转导等都取得了非常有意义的实验结果。体外培养的肿瘤细胞还具有细胞成分单一、均质性好和实验条件容易控制等优点。目前Liang等[16]已经建立了肝癌细胞系HCC-M 的蛋白质双向电泳数据库（http: //proteome.btc.nus.edu.sg /hccm/），为进一步研究奠定了基础。Seow 等[17]通过2-DE 和MALDI-TOF-MS 分析，在肝癌细胞系中发现了大约400 个蛋白质点，其中大多是管家蛋白，例如乙醇脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶等。除此之外，还鉴定出一些与肝癌发生、发展过程有关的蛋白质，包括14-3-3 蛋白、膜联蛋白，抑制素和硫氧化还原蛋白过氧化物酶等。Yu 等[18]以人肝癌细胞系BEL-7404 和正常肝细胞系L-02 为实验材料，凝胶配比和质谱鉴定揭示肿瘤抑制蛋白(maspin)在肝癌细胞中表达量显著下降；凝胶上有两个斑点为HSP27，它们在肝癌细胞中的量高于肝细胞，且HSP27 的变化与它不同的化学修饰有关，显示蛋白质翻译后修饰的动态变化对癌细胞生长有潜在影响。

3.2.3.2 血清蛋白质组学研究理想的生物标志物应具有以下特点：特异、敏感、有预见性、高浓度、在临床前和临床阶段之间起桥梁作用、可经非侵入性操作测定等。由于体液(血液、精液、唾液等)中的蛋白质易能反复获得，且血液中包含众多未知的生物标志物，这可能是因为疾病早期就可在蛋白质水平出现细微但重要的改变，因此利用血清等体液进行其蛋白质的分析以获得生物标志物是较好的选择[19-20]。分析蛋白质的改变不仅可直接获得功能相关的标志物，而且更适于标准化和临床应用。因为血清的复杂性和特殊的变化范围（如血清中白蛋白和甲胎蛋白的浓度相差7 个数量级），蛋白质图谱的描绘具有很大的挑战性。

王征等[21]比较观察肝癌患者与正常人血清蛋白质表达的差异，发现在淋巴细胞中表达并与机体免疫功能有关的淋巴组织样限制性膜蛋白在肝癌患者血清中表达明显下调，提示与肝癌患者免疫功能低下有关。而在肝癌患者血清中表达上调及单独表达的蛋白质大多是与细胞增殖、分化有关的生长因子或肿瘤相关基因的蛋白，如转化生长因子βⅢ受体、尿激酶纤维蛋白酶原激活因子受体以及转录起始因子4D 等。冯钜涛等[22]在肝癌、乙型肝炎和正常人共3 组各20 例血清的蛋白质组分析中，鉴定出7 种差异蛋白。与正常组比较，转铁蛋白、甲状腺素运载蛋白在肝炎和肝癌组低表达，α-1 抗胰蛋白酶、凝聚素、铜蓝蛋白、触珠蛋白在肝炎和肝癌组均高表达。α-1 抗胰蛋白酶在肝癌组较肝炎组高表达，而HSP27 只在肝癌组表达。7 种差异蛋白质中除HSP27 外，均是肝脏合成的急性反应蛋白，其中α-1 抗胰蛋白酶和凝聚素被认为是肝癌的潜在标记物。HSP27 也是一种在多种组织中表达的应激蛋白，可能参与细胞增生与凋亡、信号转导、雌激素反应和分子伴侣等多种生物过程。近来发现在肿瘤组织中存在HSP27 的过表达，与肝癌的预后密切相关[23]。Schwegler 等[24]对健康人、丙型肝炎病患者、丙型肝炎合并肝硬化患者及丙型肝炎合并肝细胞癌患者血清样本进行研究，用所发现的38 个差异蛋白建立分类树，预测疾病状态，对慢性丙型肝炎、丙型肝炎肝硬化、丙型肝炎相关的肝细胞癌预测的敏感性和特异性可以达到74%~95%。

3.2.3.3 肝组织蛋白质组学分析肝组织曾经是研究肝细胞肝癌最早的办法。发生病理改变时，细胞内改变的成分包括肽类、蛋白质、酶类和代谢产物等可分泌到血液中，比如大部分肝癌患者可在血清中检测出高表达的甲胎蛋白。细胞内发生改变的蛋白有的可释放入血作为临床诊断的标志蛋白，但血清中蛋白质并不能完全反应组织细胞的变化。很显然，许多蛋白只存在于细胞内并不分泌到细胞外，这部分蛋白可能是与癌症的发病密切相关的功能蛋白, 这些关键蛋白质若是结构蛋白或非分泌性蛋白，不被细胞分泌到血液中以至不能被检测出来。癌变组织和正常组织的差异在很大程度上是由功能基因及其所合成的蛋白质的不同来决定的，因此癌变组织与正常组织蛋白质组间差异的研究是寻找癌变机制相关蛋白的有效途径。

应用 2-DE 和ESI-MS/MS 技术对乙型肝炎相关的肝癌和癌旁组织进行蛋白质组学研究，发现有11 个蛋白质点在肝细胞肝癌组织和癌旁组织中存在显著差异，其中Peroxiredoxin 2、载脂蛋白A-I 前体、3-羟酰辅酶A脱氢酶Ⅱ型在肝癌组织中表达显著下降[25]。Yokoyama等[26]分析了丙型肝炎相关的肝癌和癌旁组织的蛋白质组成，也发现了11 个差异蛋白质，鉴定出肝型醛缩酶、原肌球蛋白β链、果糖激酶、烯酰辅酶Ａ水化酶、转铁蛋白轻链和精氨酸酶Ⅰ等8 个蛋白质在肝癌组织中表达显著降低。这些蛋白大都与肝细胞功能缺失以及肝癌形成有关。Lim 等[27]通过对比肝细胞肝癌患者自身的相对正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织的2-DE 结果，发现了21 个显著变化的蛋白质点，其中肌氨酸脱氢酶、肝羧酸酯酶、肽基-脯氨酸异构酶和核纤素B1 在有望作为肝细胞肝癌的候选生物标记。核纤素B1 在肝硬化和肝癌组织中的表达量最高。

3.2.4 肝细胞癌转移与复发的蛋白质组学研究对于控制肿瘤发展来说，很重要的一点就是及早发现致死的危险因素。许多因素与肝细胞肝癌扩散有关，并具有潜在的预兆作用。近来一个重要的发展趋势是用基因组学和蛋白组学方法，广泛的描绘涉及肿瘤转移、复发、分级的生物标记。生物标记可以为肝细胞肝癌的转移和复发提供除了传统组织病理学特点以外的更多信息。目前已经发现大量具有潜在预测重要性的生物标记。一个重要的方面是分析细胞表型恶性程度的分子标记，包括DNA 倍体型、细胞增殖指数、细胞周期调控因子、癌基因、肿瘤抑制基因（尤其是p53 基因）和端粒末端转移酶活性。参与肝细胞癌入侵和转移的分子包括黏附分子（E-钙粘连素、细胞间黏附分子1、层粘连蛋白5、CD44 变异体、骨桥蛋白等）、细胞外基质降解相关的蛋白酶（基质金属蛋白酶、尿激酶纤溶酶原激活系统）、血管生成调节因子（血管内皮生长因子、肿瘤内微血管密度）等[28]。另一个重要的方面是检测肿瘤相关抗原（如甲胎蛋白、黑色素瘤相关抗原、细胞角蛋白19 等）的转录，它们对肝癌细胞播散到循环中和肿瘤的转移复发都具有预测作用。Ding 等[29-30]认为肝癌的浸润和转移与其分泌一些特殊的蛋白质有关。他们应用蛋白质组学技术发现细胞角蛋白19 在MHCC97H（高转移肝癌细胞系）中高表达而在MHCC97L（低转移肝癌细胞系）中低表达，通过放射免疫技术对小鼠肝细胞癌的研究还发现细胞角蛋白19 的水平随着肿瘤的进展有所增加并且在肝癌发生肺转移后显著增加。免疫组化证实了102 例有明显肝内转移的肝癌患者血清中出现了细胞角蛋白19 阳性表达。这些蛋白在肝细胞癌转移复发中都是潜在的预测标记。

3.2.5 肝移植的蛋白质组学研究所有的供体器官在切取至保存过程中均遭受一定程度的损伤，这与热缺血、冷缺血和再灌注损伤有关，缺血再灌注损伤与移植物初期功能障碍密切关联。因而缺血再灌注损伤是肝移植术成功与否的主要因素之一。Vascotto 等[31]应用2-DE和MALDI-TOF-MS 技术发现肝移植供体肝脏中有36个蛋白在缺血再灌注损伤时发生明显变化，其中多数蛋白在脂质和能量代谢、氧化还原信号传以及氧化应激过程中发挥作用。张春潮等[32]利用荧光差异显示双向凝胶电泳并整合内标法与正、反相荧光标记，对急性排异组和对照组大鼠肝移植后的肝组织蛋白质表达谱进行了定量蛋白质组学研究。结果表明，有27 个蛋白点的表达水平在急性排异组有显著差异，其中19 个差异表达蛋白经胶内酶切后，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱获得相应的肽指纹图谱并结合数据库搜索得到鉴定。这些差异蛋白的分子功能主要表现为氧化还原活性及离子结合活性，实验结果将有助于进一步了解器官移植排异反应的分子机制。此外，蛋白质组学在肝移植免疫耐受和肝移植术后并发症的研究也在逐渐开展之中。