2 Gilbert 综合征与UGT1A1 基因变异

Gilbert 综合征为常染色体隐性遗传疾病, 在人群中约有6%的发病率, 其特征表现为在无肝实质病变和溶血前提下的慢性、轻度非结合型胆红素增高。患者无明显症状, 血清胆红素和黄疸呈波动性, 常因疲劳、应激、饮酒、感染、高热和妊娠而增加。Gilbert 综合征患者UGT1A1 基因启动子TATAA 盒中TA 重复序列发生突变, 其编码的酶分子结构虽正常但活性下降, 可降至正常的30%左右[8]。TA 重复序列( TA) 5- 8 参与调节UGT1A1 转录活性, TA 重复序列的增加降低了TATAA 结合蛋白与TATAA 盒的亲合力。常见纯合子( TA) 7TAA 替代正常的( TA) 6TAA; 部分患者表现为( TA) 5 或( TA) 8。Gilbert 综合征UGT1A1 基因的多态性也可表现在编码区。亚洲人群中罕见TATAA 启动子变异, 突变常发生在编码区。最常见核苷酸211 位G→A 点突变(G71R) , 使相应编码的甘氨酸变成精氨酸。此位点突变在日本人、韩国人及中国人中最常见[9]。另外Arg367Gly、Arg209Trp、Tyr486Asp[10- 12]等突变也可导致Gilbert 综合征。

3 CN 综合征与UGT1A1 基因变异

CN 综合征是比较罕见的常染色体隐形遗传疾病, 其Ⅰ型患者的UGT 活性完全丧失, 是惟一一种必须进行治疗的非结合型高胆红素血症。CN 综合征是因UGT1A1 基因在编码区发生突变, 引起该基因指导合成的UGT 活性完全( Ⅰ型) 或部分( Ⅱ型)丧失所致。基因突变可发生在UGT1A1 基因5 个外显子中的任意一个, 可引起翻译提前终止或移码突变, 导致氨基酸序列改变或缺失, 酶活性丧失。目前报道的UGT1A1 外显子突变已有70余种[13], 但尚未发现热点突变位点。除了外显子变异导致酶活性丧失之外, 内含子及剪切位点的基因发生变异也可以导致移码突变, 引起酶活性丧失[14- 15]。另外, 如编码区变异同时复合Gilbert型启动子变异, 也可以改变整个突变的表现型[13]。2005 年报道了中国大陆第一例CN 综合征Ⅰ型病例, 患者UGT1A1 基因第715位发生C→T 突变, 导致翻译提前终止, UGT 完全没有活性, 患者的父母为同一突变的杂合子[16]。

4 UGT1A1 基因变异的基因诊断

对于临床上出现的非结合型胆红素增高, 在排除肝实质病变和溶血以后, 应该考虑先天性非结合型胆红素代谢异常。目前, 对疑似先天性非结合型胆红素代谢异常的患者, 在基因水平有以下几种检测方法。最常用的是直接测序, 提取其基因组, 根据GenBank 公布的基因序列设计引物, 进行PCR 扩增后直接测序[17]。此方法耗费较大, 不适于大规模病例调查。可用于大量标本处理的方法主要有变性梯度凝胶电泳( denaturing gradient gelelectrophoresis, DGGE) 、单链构像多态性( single-strand conformationpolymorphism, SSCP) 和变性高效液相色谱( denaturing highperformance liguld chromatography, DHPLC) 等, 进行初步筛选后, 对阳性标本进行测序。DGGE 的原理是: 双链DNA 分子在一定变性剂浓度的凝胶上电泳时, 会在一定的时间发生部分解链,导致电泳迁移率下降, 当正常的DNA 分子和发生突变的DNA分子之间即使只有1 个碱基对的差异时, 也会在不同时间发生部分解链, 从而被分离成2 条。有研究者[18]利用双变性梯度凝胶电泳( double gratient DGGE, DG- DGGE) 检测98 份Gilbert 综合征患者的血样, 不仅可以快速检测出TA 插入异常, 并且还可以区分( TA) 6 / ( TA) 7 杂合子和( TA) 7 / ( TA) 7 纯合子。SSCP 的原理是: 单链DNA 在中性条件下会形成二级结构, 这种二级结构依赖于其碱基组成, 即使是1 个碱基的不同, 也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件下不同的电泳迁移率, 因此可以用来检测微小到1 个基因突变的差异。Francoual[19]的实验结果显示, 对羊膜细胞或绒毛膜区的胎儿基因组进行SSCP 检测, 是一种快速有效的产前诊断方法。DHPLC 技术是一项在SSCP 和DGGE 基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术, 其原理与DGGE 类似, 即通过HPLC 在部分变性的条件下可将发生错配的异源杂合双链DNA 和完全匹配的同源双链DNA 分离开来。与传统的杂合双链分析技术相比, 该技术耗时短, 分析一个样品一般仅需几分钟, 不使用放射性同位素, 自动化程度高, 但需要置备一台HPLC 仪器。目前该技术主要用来检测200～300 bp 的DNA 片段, 对长的DNA 片段的检测尚未见报道, 已经应用于UGT1A1 基因异常的检测[20]。

5 先天性非结合型高胆红素血症的临床治疗进展

5.1 一般治疗现状

除了CN 综合征Ⅰ型以外, Gilbert 综合征和CN 综合征Ⅱ型患者的UGT 仍有一定活性, 不会或极少发生核黄疸。Gilbert 综合征无须特殊治疗, 而CN 综合征Ⅱ型口服苯巴比妥可以降低血清胆红素水平, 通过蓝光照射使非结合胆红素内侧氢键断开, 形成可溶于水的异构体, 不须结合即可从胆汁排泄。随着年龄增长,皮肤厚度增加, 相对面积减少, 此种方法的疗效减退。CN 综合征Ⅰ型患者体内UGT 活性完全丧失, 如不加以治疗, 患者在婴儿期即可能死亡, 幸存者有神经系统后遗症, 多在儿童期和青春期死亡。目前治疗CN 综合征Ⅰ型最有效的方法是肝移植, 但成本高、并发症多。

5.2 基因治疗研究进展

肝细胞移植可以治疗CN 综合征Ⅰ型[21], 但未经选择的肝细胞生物活性差, 再生能力低, 单纯移植肝细胞效果不显著。将编码UGT 的基因克隆入永生化的肝细胞, 所得重组肝细胞植入CN综合征Ⅰ型模型Gunn 大鼠脾脏后, 大鼠体内非结合型胆红素水平持续、稳定下降, 时间可持续达120 d[22]。但是, 目前细胞永生化的技术还不成熟, 缺乏安全的永生化方法, 细胞培养量也难以满足临床治疗需要, 没有建立合适的培养系统, 这些问题使得该方法距离真正用于人体治疗还很遥远。

目前替代肝移植的另一个研究热点是治疗性疫苗。将携带UGT1A1 基因的质粒肌肉注射Gunn 大鼠模型, 在肌肉组织中可以检测到UGT 表达, 在随后的2～4 周内大鼠体内胆红素水平下降, 而每月经静脉注射一次重组质粒可将胆红素水平维持在正常范围长达5 个月[23]; 而使用具有肝脏特异性启动子所构建的重组质粒蛋白, 则可持续表达长达8 个月, 并且引起的免疫反应比普通真核表达质粒轻[24]。病毒来源的基因治疗载体可以形成假病毒颗粒模拟病毒感染的过程, 持续表达目的蛋白, 因而受到人们重视。

van der Wegen[25]等利用肝脏特异性慢病毒载体表达UGT,经静脉注射一次, 一年后Gunn 大鼠体内的胆红素仍维持在正常水平, 并且在大鼠30%的肝实质细胞内都可以检测到UGT 表达。Seppen[26]等报道, 接种慢病毒载体表达UGT1A1 的胎鼠在出生一年后体内胆红素水平仍正常, 而出生当日接种的Gunn 大鼠体内胆红素水平可以维持18 周, 表明对于先天性代谢性疾病来说, 开始治疗的时间越早, 治疗效果也越好。