【摘要】 目的 探讨Smad 7 基因对大鼠肾小球系膜细胞(MsC) Ⅰ、Ⅲ型胶原(Col Ⅰ、Col Ⅲ) 表达的影响,为试图运用Smad 7 对肾纤维化进行基因治疗提供实验依据。方法 经脂质体介导将含有Smad 7 重组表达质粒转染大鼠MsC ,用G418 筛选及Northern blot 、Western blot 法鉴定;又分别采用RT2PCR 和Western blot 法,检测转染阳性MsC 克隆Col Ⅰ、Col Ⅲ表达改变。结果 成功建立稳定高表达Smad 7 的阳性MsC 克隆(S-22 与S-26) ,并证实两阳性MsC 克隆Col Ⅰ及Col ⅢmRNA 及蛋白的表达均被明显抑制, 其中S222 克隆Col Ⅰ及ColⅢmRNA 表达分别降低47 %和56 % ,其蛋白表达分别降低65 %和54 %。结论 Smad 7 可能通过抑制组织内Col Ⅰ及Col Ⅲ的生成而起到减轻肾纤维化进展的作用。
大量研究表明,转化生长因子2β( t ransforming growt h factor2β,TGF2β) 的作用是介导肾小球硬化发生的共同通路[ 1 ] , 其不仅能促进肾小球系膜细胞(mesangial cell ,MsC) 合成细胞外基质(ext racellular matrix ,ECM) , 也能通过诱导基质降解酶抑制因子的表达,加剧ECM 在肾组织内的积聚[ 2 ] 。近年来的实验研究证实, TGF2β是通过与靶细胞膜上的相关受体( Tβ2R) 结合后,磷酸化激活丝/ 苏氨酸激酶受体信号转导分子Smad (果蝇Mad 和C. elegans Sma 基因产物的同类物) ,如Smad 2 和Smad3 ,后与胞质内Smad 4 形成异聚体转移至核内,并在核内相关因子的共同作用下,参与对一些靶基因表达的调节而完成的[ 3 ] 。而对于Smad 家族中的Smad 7 则认为是Smad 2 、Smad 3 和Smad 4 三聚体的抑制因子,其可多环节阻断TGF2β信号通路,具有抗纤维化功能[ 4 ] 。因此,本实验将Smad 7 cDNA 经脂质体介导转染大鼠MsC ,观察转基因MsC克隆Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的改变,以进一步阐明Smad7 抗组织纤维化的作用机制, 为实施对组织或器官纤维化的基因治疗提供理论依据。
材料和方法
主要试剂 大鼠重组pcDNA3. 02Smad 7 (日本Dr . Takeshi Imamuna 馈赠) , Smad 7 cDNA 探针(复旦大学上海医学院分子病理实验室保存) ,Lipofectin 及G418 ( Gibco BRL 公司) ,无血清培养液(Sigma 公司) , Smad 7 多克隆抗体、Col Ⅰ、Ⅲ单克隆抗体(Oncogene 公司) 。
重组Smad 7 真核表达质粒的鉴定与超纯质粒的制备 pcDNA3. 02Smad 7 经EcoR Ⅰ和X ho Ⅰ双酶切,及EcoR Ⅰ单酶切鉴定,送测序(联合基因公司) 后大量扩增,Qiagen 试剂盒纯化。
细胞培养 实验用MsC 为其第8 代,其制备及鉴定可参阅文献的常规方法[ 5 ] ,培养在含10 %胎牛血清的RPMI21640 培养基中,37 ℃,5 %CO2 培养箱常规培养,细胞呈贴壁生长。所有培养试剂均分别购自Gibco BRL 公司和Sigma 公司。
Smad 7 基因转染入MsC 及阳性细胞克隆的筛选 呈融合生长的MsC 以1 ×106 个的密度转入6孔板内,到呈现30 %～50 %融合生长时弃完全培养液,分别加含有Lipofectin 和pcDNA3 . 02Smad 7 或
Lipofectin 和pcDNA3. 0 混合液的无血清培养液1 mL ,20 h 后,弃无血清培养液,加入含20 %血清的完全培养液,72 h 后再改用含G418 (600 μg/ mL)的完全培养液。20 d 后克隆形成,挑取单克隆细胞并将其种入24 孔板中,继续扩增培养直至生长融合,再转入6 孔板,最后转入100 mL 培养瓶中。
对含有Smad 7 MsC 克隆的鉴定 分别采用Nort hern blot 法及Western blot 法检测Smad 7mRNA 及其蛋白表达水平。Nort hern blot 法简述如下: 阳性克隆细胞生长至亚融合时, 用Trizol( Gibco BRL 公司) 抽提总RNA ,取10 μg 进行1 %变性琼脂糖凝胶电泳,转膜,紫外交联固定,α232 PdA TP (Amer sham 公司) 随机引物法标记Smad 7cDNA 探针,按常规方法[ 6 ] 进行Nort hern blot 杂交。Western blot 法简述如下:阳性细胞克隆生长至亚融合时,弃完全培养液, PBS 洗2 次,20 μL 蛋白依标准方法进行8 %SDS2PA GE 变性电泳,转移至PVDF 膜。一抗为山羊抗小鼠Smad 7 多克隆抗体(1∶200) ,二抗为生物素化兔抗山羊IgG(1∶500 ,ABC 试剂盒,Vector 公司) 。
逆转录聚合酶链式反应( RT2PCR) 法检测ColⅠ与Col ⅢmRNA 阳性细胞克隆生长至亚融合时,用Trizol 抽提总RNA ,等量cDNA 依照Advantage cDNA PCR kit (Clontech 公司) 提供的步骤进行PCR。PCR 引物(Prime 5 软件合成,Genbank 核对特异性) 如下:内参照GAPDH (上游: 5′2 ACCACA GTCCA TGCCA TGCCA TCAC23′; 下游: 5′2CCACCACCCTGTTGCTGTA G23′,预计扩增片段长度为450 bp ) 。Col Ⅰ ( 上游: 5′2 A GGGTCA TCGTGGCTTCT23′; 下游: 5′2 CCTTCGCT2TCCA TACTCG23′,预计扩增片段长度为703 bp) 。Col Ⅲ ( 上游: 5′2 CTCCCA GAACA TTACA TACCA23′; 下游: 5′2 AA TGTCA TA GGGTGCGA TA23′,预计扩增片段长度为256 bp) 。反应条件为94℃预变性7 min , 94 ℃变性30 s , 60 ℃退火30 s ,72 ℃延伸1 min , 共32 个循环。并分别设空载体转染组和未转染MsC 组,与其作对比观察和分析。
Western blot 法检测Col Ⅰ与Col Ⅲ蛋白 阳性细胞克隆生长至亚融合时,弃完全培液, PBS 洗2次,取20μL 蛋白按标准方法作7. 5 % SDS2PA GE变性电泳,转移至PVDF 膜,一抗分别为兔抗鼠ColⅠ、Ⅲ多克隆抗体(1200 ,Oncogene 公司) ,二抗为生物素化羊抗兔IgG(1∶500 ,ABC 试剂盒) 。并分别设空载体转染组和未转染MsC 组,与其作对比观察和分析。
定量和统计分析 用凝胶成像仪进行拍照记录, Kodak Digital Science 1D 扫描分析系统测定条带的积分光密度( ID) ,其中ID 值等于平均光密度与条带面积之乘积。进行半定量分析,将各组内参照(β2actin 或GAPDH) 的实际ID 值均设为100 ,样本的实际ID 值与之相比后得到的数值为样本的相对含量。每一样本的强度之比的最后结果为3 次独立电泳实验的平均值。经SPSS9. 0 统计软件对数据进行标准差计算和t 检验。
