3　超声微泡携带基因的离体研究

Taniyama等^{[ 2 ]}研究了体外超声造影剂Op tison介导下质粒对人主动脉EC和VSMC的转染情况。实验选用的质粒为含SV40 启动子的荧光素酶表达载体,Op tison和含质粒的溶液混合孵育30 s,将20μg的质粒加入培养孔,在37℃下用2. 5 W / cm2 的超声照射1min,间隔1 min后重复8次。24 h后对EC荧光素酶的活性进行检测,结果显示与单纯使用质粒转染组(A组)相比,超声+质粒作用组(B 组)的酶活性提高了70倍,而Op tison与超声的联合作用组(C组)酶的活性提高了近8 000倍,在对VSMC细胞的转染中,Op tison与超声的联合作用组的酶活性亦有7 000倍的提高。同时,辐照后瞬间对细胞的扫描电镜照片显示B组和C组细胞的细胞膜有裂孔出现,A组则未见,且C组裂孔明显大于B组,这一现象可以解释不同条件下的基因转运效率的差别;转染24 h后再次电镜显示均未观察到裂孔,表明超声微泡对细胞膜作用是可逆的、安全的。

刘玉凤等^{[ 6 ]}探讨了超声造影剂声诺维( SonoVue)在脂质体介导的增强型绿色荧光蛋白( EPGFP)基因转染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的实验中对转染效率的影响。研究者在单孔培养皿中加入HUVEC细胞悬液,每孔加入脂质体介导的EPGFP 4 μg,加或不加微泡造影剂及给予不同条件的超声辐照。24 h后,用荧光显微镜及流式细胞仪检测基因的转染效率与EPGFP在细胞内的表达。结果显示和对照组相比单纯超声组转染率有所提高,而超声+微泡组转染率提高最明显,并且该组中超声辐照60 s、机械指数1. 4时转染效率最高;超声辐照90 s、机械指数1. 0时转染率最高。

RNA干涉技术是利用体外合成的短双链RNA( siRNA) ,进入细胞后激活胞内Dicer诱导同源RNA降解,抑制特定基因表达。如何使siRNA有效安全的进入靶细胞是该技术进一步应用的难点之一。Kinoshita等^{[ 7 ]}进行了利用超声微泡导入siRNA 的尝试。在人B淋巴细胞株(BJAB)细胞的悬浮培养液中加入浓度2%的造影剂Op tison和可表达绿色荧光蛋白(EGFP)的pEGFP2C3质粒,再分为两组分别加入以EGFP基因为靶点的siRNA和用于对照的siRNA,经功率5. 5W的超声持续10 s的声振处理, 16 h后发现两组质粒的转染率无差异,但加有以EGFP基因为靶点的siRNA组的转染质粒阳性的细胞中, EGFP的表达明显降低。进一步对自身含有EGFP 基因的大鼠C166-GFP细胞,加入上述siRNA、5%Op tison并进行同样的声振处理, 48 h后11%的存活细胞EGFP表达被抑制,将超声辐照方式改为2. 75 W 的脉冲模式后可将抑制率提高到15%。

4　超声微泡携带基因在再狭窄治疗中的研究

4. 1　血管内皮生长因子(VEGF)基因

VEGF基因是目前在超声微泡转染的应用中研究较多的基因。VEGF是血管内皮的特异性生长因子,其家族成员包括VEGF-A、B、C、D和胎盘生长因子,其中经典的VEGF-A是一种相对特异的血管EC促有丝分裂原,有5种异构体,以VEGF121和VEGF165为主要形式。在成人, VEGF-A 在几乎所有的血管组织中有表达,特别是在大血管、骨骼肌、心肌的血管以及分布在内分泌腺中的有孔血管,从而提示VEGF-A在全身血管内平衡的维持上起着不可缺少的作用。VEGF-A的作用与其在局部的聚集有关,小剂量的VEGF-A用于维持血管内的平衡, 外胚层的更新, 一氧化氮(NO)和前列腺素的生成,进而使血管舒张,防止血栓形成,抑制平滑肌细胞的增殖;而更大的浓度则有促进血管生成的作用,即生理性的血管生长。但这种浓度和生理作用的关系与机制还有待于进一步的研究。在缺血和损伤的血管中, VEGF-A 受体的上调对血管恢复足够的血液灌注和维持内皮的完整性亦有重要意义,同时,VEGF能促进动脉内膜剥脱后的再内皮化,阻止血小板及白细胞黏附点始发的丝裂原信号,从而抑制了内膜的增殖^{[ 8 ]} 。

VEGF基因是心血管基因治疗的理想选择,因为VEGF在体内的半衰期非常短,仅为6 min,直接给药将很难维持有效的药物浓度。美国GenTech公司曾尝试用VEGF蛋白治疗冠心病、心肌缺血,由于Ⅱ期临床完成后确认疗效不好,于1999年1月停止开发。基因治疗则可以解决上述问题。此外,由于VEGF为分泌性蛋白,合成后分泌到细胞外,以旁分泌或自分泌方式作用于靶细胞的VEGF受体,因此通过向血管内皮转染VEGF基因,即使基因转染效率很低,也可以实现满意的生物学效应^{[ 8 ]} 。