4. 4　反义核酸

反义核酸的核苷酸序列与靶RNA 或靶DNA 互补,抑制或封闭特定的基因转录和表达。然而由于难以通过细胞膜,细胞内降解过快等原因,临床疗效并不理想。Kutryk等^{[ 16 ]}进行的临床随机对照试验表明,在冠脉内支架置入术后,将10 mg针对c-myc基因设计的寡脱氧核苷酸直接经导管导入支架术后的冠脉,希望能抑制靶细胞c-myc的表达,结果却表明该方法并没有减轻内膜的增生和远期的血管再狭窄的发生。

AVI-4126是目前广泛使用的一种作用靶点为c-myc癌基因的反义寡核苷酸,可以显著抑制损伤内皮的增殖,并在动物实验中得以证实,为了克服传统的给药方式冠脉内注射和涂层支架缓慢释放的转运效率难以令人满意的问题。Kip shidze等^{[ 17 ]}提出了超声微泡携带AVI-4126这一新的输送方式,研究者没有采用一般的声振破坏微泡定向释放技术,而是将全氟碳微泡与2 mg的AVI-4126混合后注射入行冠脉支架置入术猪的外周静脉中,借助微泡自身的黏附特性,使其与损伤的EC特异性结合,并被中性粒细胞和巨噬细胞吞噬进而抑制这些细胞c-myc的表达,结果表明,这一方法有效减少了支架置入处血管炎性介质的释放和炎症细胞的聚集,抑制了损伤内膜的增生。

Porter等^{[ 18 ]}使用荧光电镜证实全氟碳声振白蛋白微泡的确能够有选择的和受损血管内皮特异性结合,接着使用行冠脉支架置入术的小型猪进行了进一步的实验,实验分4 组,分别是A 组: 静脉注射单纯反义c-myc +经胸超声辐照(对照组) ; B组:静脉注射反义c-myc和微泡+经胸超声辐照; C组:仅静脉注射反义c-myc +微泡; D 组: 冠脉内注射反义c-myc。结果表明,支架置入45 d后, C组和D组的c-myc表达最低,通过血管内超声和组织化学的测量, C组的血管狭窄程度比对照组减少了33% ,内膜增生面积减少28% ,而同时有超声辐照的B组c-myc表达并未显著减少,对内膜增殖抑制的效果亦低于C、D两组,这与既往的一些微泡声振破裂提高基因传递效率的实验相矛盾^{[ 2, 5, 15 ]} 。Porter解释可能与携带基因的微泡还未到达冠状动脉就已在左心室被破坏有关,同时指出微泡与受损内皮的特异结合与补体C3有关,而炎症介质C反应蛋白可以上调C3的表达^{[ 19, 20 ]} 。

4. 5　诱饵寡核苷酸

细胞的增殖依赖于一系列细胞周期调节基因的激活,研究表明,合成与顺式元件相一致的双链寡聚脱氧核苷酸(ODNs) ,其含有特定转录因子DNA结合部位的共有序列,导入靶细胞后,作为诱饵( decoy)在胞浆内与特定的转录因子结合,可以防止转录因子进入细胞核,从而阻止了特定基因的激活。

E2F转录因子家族是细胞周期中的重要调节环节之一,它通过特异性的DNA序列,与靶基因的启动子结合,从而实现转录的调节。Morishita等^{[ 21 ]}研究表明特定的双链寡聚脱氧核苷酸(OND)作为诱饵和E2F结合后,可以防止大鼠颈动脉损伤模型中血管内膜的增殖,揭示了其作为基因治疗中新的decoy即诱饵策略的可行性。Morishita使用的基因导入方法为颈动脉插管注射,为了进一步提高实验的靶向性和减少不良反应, Hashiya等^{[ 22 ]}使用了超声造影剂Op tison携带诱饵分子。在转染球囊损伤的SD 大鼠颈动脉实验中,将含有100μg E2F decoy和25% Op tison的混合液导入损伤颈动脉后,使用1MHz, 2. 5W / cm2 的超声辐照2 min,结果显示,与单独使用decoy比,超声辐照组展现了更好的内膜增殖抑制效果。

核因子κB (NF2κB)是一种参与多种炎症介质基因表达的转录因子。Inagaki等^{[ 23 ]}使用NF-κB decoy作为decoy分子对小鼠的股动脉损伤进行了实验,将90μL NF-κB decoy(20μg)和10μL超声微泡混合,进入损伤的动脉后,使用1MHz, 1. 0W / cm2 的超声辐照30 s, 14 d后对血管损伤部位取材,染色后测量增生内膜的厚度和PCNA、细胞间黏附分子-1 ( ICAM-1)阳性细胞的比例,结果表明相对于无微泡或使用无意义decoy组,NF-κB decoy与微泡的联合作用显著减轻了炎症反应,抑制了损伤内膜的增生。

5　展望

分子生物学的迅猛发展,为心血管疾病提供了大量可用于治疗的基因,随超声造影技术发展而来的超声微泡靶向释放技术为基因治疗的顺利实施提供了一种全新的技术手段,其治疗的靶向性及无创性的优点已在大量实验中得到了充分的肯定,但仍有许多不成熟之处。目前的靶向机制大多数还是基于超声微泡理化作用和机体自身白细胞对异物的非特异性免疫应答,其基因传递效率与临床要求仍有一定距离。为了进一步提高效率,可以针对不同的病变组织开发不同的单克隆抗体,如针对介入治疗中损伤的EC表达的ICAM-1、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1) 、内皮细胞选择素( E-selectin) 、血小板选择蛋白( P-selectin) ,制备这些分子的单克隆抗体,将其装配在微泡表面,通过特异性的免疫反应,使微泡与损伤内皮结合,探索基因的高效转运途径^{[ 24 ]} ;也有学者使用含有超顺磁性颗粒的超声微泡,将磁性药物导向和微泡技术结合,在磁场(MRI) 和超声的联合作用下, 提高基因的传递效率^{[ 25 ]} 。

综上所述,在不远的将来,超声介导的靶向技术将使心血管疾病的基因治疗更加特异、安全和高效,在血管再狭窄治疗领域会有广阔的应用前景。