【摘要】　目的　通过2型糖尿病肾病( T2DN)大鼠模型,探讨早期糖尿病肾病(DN)肾小管间质的病理变化及转化生长因子β1(TGF2β1) 、肝细胞生长因子(HGF)和结缔组织生长因子(CTGF)表达变化及意义。方法　高热量饲料喂养加腹腔注射链脲佐菌素( STZ) ,复制T2DN模型。14周和20周时用HE染色及PASM染色方法观察肾小管及间质的病理变化;用免疫组织化学的方法观察肾小管间质中TGF2β1、HGF和CTGF的表达变化,并进行半定量分析。结果　模型组大鼠具有血糖异常、胰岛素抵抗及肾小球高滤过率、白蛋白尿等特点;部分肾小管上皮细胞萎缩、脱落、空泡化,基底膜增厚及小管间质纤维化。免疫组织化学方法提示TGF2β1和HGF14周及20周时在2组大鼠小管间质的表达差异有统计学意义( P < 0. 01) ; CTGF在2组大鼠肾小管间质有少量表达,差异无统计学意义。结论　早期DN大鼠模型中肾小管间质已开始出现纤维化改变; TGF2β1、CTGF和HGF在早期DN的肾小管及间质中的表达发生变化,提示TGF2β1、CTGF和HGF在肾小管间质的表达失衡与DN肾小管病变的进展相关。

随着社会的进步、生活水平的改善、诊断技术的提高, 2型糖尿病的患病人数在大幅度的增长。而糖尿病肾病的患者也将随之增加^{[ 1 ]} 。近期研究^{[ 2, 3 ]}发现糖尿病肾损伤同时也发生在肾小管,而且糖尿病患者肾功能的恶化程度与其肾小管间质损伤程度密切相关。但是关于糖尿病时肾小管的损伤机制不太明确。

有学者认为在慢性肾脏病变中,肾组织中异常表达的细胞因子发挥了重要的作用。为此,本实验通过高热量饮食结合适量的链脲佐菌素( STZ)腹腔注射复制与人类2型糖尿病肾病类似的动物模型,观察其早期肾小管及其间质的病理变化,并研究转化生长因子β1(TGF2β1) 、结缔组织生长因子(CTGF)和肝细胞生长因子(HGF)蛋白表达变化及意义。

1 　材料和方法

1. 1　动物模型的建立

44只健康清洁级雄性Wistar大鼠,体质量160～230 g,周龄8周,由首都医科大学实验动物科学部提供(许可证号: SCXK京200520006) ,在首都医科大学实验动物科学部的屏障设施内饲养。采用抽签法随机分成对照组(A组, 20只)和模型组(B组, 24只) ,分别饲予基础料和高热量饲料(70%常规饲料加10%的猪油、5%胆固醇、5%豆油和10%蔗糖构成) ,由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心配制(许可证号:SCXK2军20022018)。喂养5周后,裁尾采血测夜间禁食血糖(FBG)、血胰岛素水平(FINS) ,并计算血胰岛素敏感指数( ISI) ;第6周,B组按30 mg/kg的剂量一次性腹腔内注射STZ (现溶于0. 1 mol/L 柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液, pH 4. 2) ,A组按相同剂量注射柠檬酸缓冲液。B组继续高热量饮食喂养。第8周,大鼠夜间禁食后,按2 g/kg的剂量腹腔内注射50%葡萄糖溶液,并于注射前、注射后1 h及2 h,分别裁尾采血测血糖。将糖耐量试验中1 h血糖≥13 mmol/L,伴胰岛素抵抗作为判定2型糖尿病大鼠模型成功的标准。按照上述标准,B组有3只大鼠因未达标准而剔出。

1. 2　标本收集

于实验开始后第6周、14周和20周用代谢笼收集24 h尿,离心,保存于- 70 ℃冰箱中待测尿白蛋白及肌酐。14 周和20 周分别用2%戊巴比妥钠( 35mg/kg)腹腔麻醉后处死大鼠, 14周时A、B两组各10只, 20周时A组10只,B组11只。留取标本,包括经腹主动脉采血,离心,保存于- 70 ℃冰箱中待测血胰岛素;采血后快速取出肾脏和胰腺,用冰盐水灌洗后滤纸吸干,立即用中性甲醛溶液固定24 h后,石蜡包埋,切片,进行HE、PASM及免疫组织化学染色。

1. 3　生化指标

血糖用葡萄糖氧化酶法检测;肌酐由Beckman自动生化分析仪进行检测;尿白蛋白及血胰岛素的测定采用放射免疫法,按北京北方生物研究所的操作手册进行。

1. 4　病理检测

常规方法制备光镜切片,分别作HE和PASM染色观察肾小管间质,免疫组织化学染色观察TGF2β1、HGF和CTGF的表达,并用Leica Qwin Standard医学图像分析系统进行图像分析处理,每张组织切片随机在皮质区选取10个不重叠的视野(尽量避开肾小球及血管) ,计算阳性着色面积与整个视野的相对面积比,平均值为该切片的相对阳性着色面积比。

1. 5　统计学方法

数据采用均数±标准差( ^—x ±s)表示,所有数据应用统计分析软件SPSS 11. 5进行t检验, P < 0. 05为差异有统计学意义。