2. 2　调控乳糖酶基因表达的元件　乳糖酶上游启动子元件,是位于转录起始位点上游,由150个碱基对组成的片段,这个序列在鼠、兔、猪和人中都是保守的。乳糖酶上游启动子元件包含了3 个顺式作用元件(CE1a, CE2c and GATA-site) ^{[ 7 ]}。尾侧型同源转录因子2 (Cdx-2)和同源转录因子HOXC11通过与CE1a结合启动基因的转录。Cdx-2还能与另一个位点结合,这个位点与乳糖酶基因的TATA盒重叠。然而,究竟是Cdx-2直接与这个位点结合,还是通过蛋白质相互作用,即转录起始复合体,有待于进一步的研究来阐明。HOXC11只在人胚胎时期肠道中表达,出生后即消失,表明它在肠道早期的发育中发挥特定的作用^{[ 8 ]}。还有许多因子通过与CE1a结合抑制乳糖酶表达,这些因子可能在不表达Cdx22的细胞中发挥抑制乳糖酶转录的作用,但尚未被鉴定出,提示Cdx-2激活乳糖酶启动子可能具有组织特异性。CE2c是乳糖酶启动子中的关键元件, CE2c位点发生突变后,乳糖酶启动子的活性大大降低了^{[ 8 ]}。体内实验表明, HNF21α在LCT表达过程中发挥重要的作用,与野生型小鼠相比,体内不表达HNF21α的小鼠,LCTmRNA降低了95%^{[ 9 ]}。肝细胞核因子1α( hepatocyte nuclear factor 1 alpha, HNF-1α)能与乳糖酶启动子(猪、鼠、人) 中的CE2c 位点结合, 激活启动子的活性。而且,HNF-1α和Cdx-2还具有协同作用^{[ 10 ]}。锌指转录因子(GATA因子)在体内很多组织中均有表达。GATA-1、-2、-3在造血干细胞中调节T淋巴细胞、红细胞、巨核细胞的分化特异性基因的表达; GATA-4、-5、-6在中胚层和内胚层来源的组织(如心、肝、肺、性腺和肠)中调节组织特异性基因的表达。GATA-4、-5、-6均能结合并激活人和鼠的乳糖酶启动子,其中GATA-4是调节鼠LCT表达的关键的GATA因子。GATA-4 /HNF-1α和GATA-5 /HNF-1α具有协同作用。远端调控元件增强子也参与调控乳糖酶的转录,但作用较弱。猪的乳糖酶增强子已被鉴定出来,位于乳糖酶基因上游- 850bp的位置,这个增强子区包含3个结合位点- CE2a、nt20和CE2b,其中CE2a与HNF-1α结合, nt20和CE2b的结合位点尚未鉴定出来。人和鼠的增强子元件不是保守序列。此外,在猪和人的启动子中还发现一个负性调节区CE3。在猪的研究中发现,叉头框转录因子FREAC22、23能与之结合,而在人的CE3则与肠核因子相结合^{[ 7 ]}。增强子通过哪些因子来调节乳糖酶的转录有待于今后的研究来阐明。

2. 3　乳糖酶活性下调的机制　ATH是由于断奶后根皮苷水解酶基因表达的下调引起的,是人类普遍存在的一种肠道双糖酶缺乏症状,关于乳糖酶活性的调节因素众说纷纭。大多数研究显示,乳糖酶mRNA的水平与乳糖酶的活性和L /S比率呈正相关,说明乳糖酶活性的调节主要在转录水平^{[ 11 ]}。但也有很多学者提出不同的观点,有学者提出乳糖酶活性的调节由顺式作用元件调节。有学者利用乳糖酶编码区中多个单核苷酸多态性来研究稳定状态的乳糖酶mRNA水平,发现不同类型的乳糖酶持续活性者乳糖酶基因是不对称表达的,说明乳糖酶等位基因是被独立调节的^{[ 12 ]} ,因此,推测可能存在一个待检测的具有反式作用的DNA结合蛋白,其只能与一种乳糖酶等位基因结合并从而影响转录以及mRNA的稳定性。Sebastio等^{[ 13 ]}发现,乳糖酶mRNA水平同乳糖酶活性不相关,故推测乳糖酶活性的调节在转录后水平。在乳糖酶非持续性的个体进行代谢标记研究,观察到乳糖酶蛋白合成速度减慢以及乳糖酶原合成减少。研究者还检测到乳糖酶原的生物合成与乳糖酶mRNA水平相关但与乳糖酶活性不相关。甚至,在ATH的个体中还观察到乳糖酶的嵌合调节。

2. 4　决定ATH的基因　决定ATH的基因位于2q21乳糖酶基因5′端的一段47 kb的区域。对这段47 kb区域进行序列分析,发现两个单核苷酸多态性C /T-13910 ( rs4988235) 和G/A-22018 ( rs182549) ,分别位于离乳糖酶起始密码子上游14 kb和22 kb的位置上。C/T-13910和G/A-22018分别位于微小染色体维持蛋白6基因的第13和第9内含子。

自2002 年Enattah 等^{[ 14 ]}提出根皮苷水解酶基因上游C /T-13910和G/A-22018变异型是LD的基因标志物以来,关于这两个单核苷酸的研究很多。对数百个肠黏膜活检的分析表明,基因型C/C-13910 与乳糖酶活性( < 10 U /g蛋白)呈负相关,而基因型C/T-13910和T/T-13910 与乳糖酶活性呈正相关。C /C-13910的出现频率与已报道的芬兰人、法国人、非洲美国人、南韩人、北美高加索人ATH 的患病率是一致的^{[ 15 ]}。然而,肠道微小染色体维持蛋白6表达产物的多少与乳糖酶活性无相关性,说明微小染色体维持蛋白6 基因对ATH的影响只限于结构上。Caco-2细胞是人结肠癌上皮细胞( the human colon carcinoma cell, Caco-2) ,具有与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接,形态学及生化性质都与小肠上皮很相似,因而被大多数实验用作为研究小肠表皮细胞转运和代谢的体外模型。变异型C-13910和T-13910均能增强乳糖酶启动子的活性。然而在未分化的Caco-2细胞中研究发现,与包含C-13910的区域相比,包含T-13910的区域使乳糖酶启动子的活性增加了25% ～75%^{[ 16 ]}。在海拉细胞(Hela cell)和已分化的Caco22细胞的核提取物中,利用电泳迁移率变动分析,发现变异型T-13910和核因子之间存大很强的相互作用;与之相反的是,变异型C-13910与核因子只有微弱的相互作用,表明变异型C-13910 和T-13910 LCT启动子活性的差异是由于它们与核因子亲和力不同^{[ 17 ]}。

乳糖酶增强子至少由Oct-1、GATA、叉头框和HNF24α结合位点构成,变异型C /T-13910位于增强子的中央。C-13910和T-13910的增强子活性也存在很大差异,变异型T213910转录活性是C-13910的3～6倍。用含有T-13910的DNA片段进行DNA亲和提纯分析表明,八聚体结合转录因子(Oct21)与32磷酸甘油醛脱氢酶共纯化。Zheng等^{[ 18 ]}证明, 32磷酸甘油醛脱氢酶与Oct21具有相互作用,这可以解释为什么二者共纯化。超迁移分析表明, Oct21能直接同变异型T-13910结合,且强于Oct21与变异型C-13910之间的结合^{[ 19 ]}。变异法分析T-13910增强子上Oct21结合位点,发现这个位点变异后乳糖酶表达产物减少一半。同理,应用变异法分析GATA、叉头框和HNF24α与T-13910 增强子的结合位点,发现这些位点变异后T-13910增强子的活性显著地降低了,表明这几个结合位点是T-13910 增强子的重要因子,可能参与调节乳糖酶表达。与之相反的是, Cdx-2结合位点的变异对T-13910增强子的活性无显著作用。Oct-1、GATA-6、HNF-4α、Cdx-2、HNF-1α、HNF-1β和T-13910 增强子共转染分析证明, Oct-1只有和HNF-1α一起同时结合到相应的位点,才能激活报道基因的表达。虽然HNF-1α结合基序位于C /T-13910增强子之外,但HNF-1α很可能通过与启动子结合发挥作用。对变异型G/A-22018进行类似的分析并未发现ATH者G/A-22018表型的不同所造成的启动子活性显著差异^{[ 16-17 ]}。

3　小　结

LD在人群中的患病率高,其中最常见的类型是ATH,影响了全世界约60亿人口。随着牛奶和奶制品消费者的增加,L I的问题逐渐得到人们的重视。近半个世纪以来,关于这方面的研究比比皆是,并且已经深入到基因水平,目前已经能通过基因诊断早期发现LD个体,然而对于乳糖酶基因表达的调控机制尚未完全明确,有待于今后的研究来阐明。