2. 1. 2　HCV　C区为靶点的RNAi Seo等^{[ 12 ]}利用RNAi技术将针对HCV C区的小分子siRNA导入人肝癌细胞Huh-7进行了初步研究,结果特异性siRNA可在细胞内起到抗HCV的作用。

2. 1. 3　IRES为靶点的RNAi　IRES包括HCV 5′NCR和部分C区基因,有稳定的空间构象,含有核糖体有效结合部位和与内部翻译起始相关的起始因子结合部位,它以内部起始调控介导HCV病毒蛋白的翻译启动,在翻译调控中具有重要作用, IRES是RNAi基因治疗的重要靶位。饶林等^{[ 13 ]}以IRES为靶点,将T7 siRNA导入HCV IRES介导荧光素酶表达的转基因细胞中,通过测定荧光素酶的量,评价T7 siRNA对HCVIRES介导基因表达的抑制作用。结果表明,针对IRES所设计的siRNA,有效地降低了其介导的蛋白翻译水平,为探索以siRNA为基础的新型HCV治疗药物提供了基础资料。

RNAi是自然界存在已久的一种抗病毒机制,而HCV又能在人体内持续存在,说明HCV可能通过某一机制在胞内影响siRNA 的形成, 从而逃避机体的免疫。但体外设计的siRNA则可绕过这一过程,避开HCV的逃逸机制,达到治疗目的。RNAi效率高,极低剂量即可达到抑制效果( > 80% ) ;siRNA 本身序列短, 不会引起非特异性的细胞免疫反应;RNAi作用不依赖于病毒的复制;同时应用针对多处靶序列的siRNA则可有效防止抗性变异株的出现。上述特点使该技术用于HCV治疗具有无法比拟的优越性。然而, RNAi的具体作用机制尚未完全清楚,加上机体与细胞内的复杂环境,RNAi的过程似乎也不像理论上那么简单,要用于人体治疗,其药代动力学也是研究的重点。因此, RNAi用于HCV治疗的研究成果虽很丰富,但目前多限于体外研究。要进一步有所突破,一方面有必要在更接近人体的大动物模型体内进行实验,另一方面还需要解决如何安全有效地将siRNA导入体内、定位于肝脏细胞等问题。

2. 2　病毒抗原编码基因的转基因表达　因HCV的高度变异性,目前, HCV抗原编码基因的表达主要集中于一些相对保守的区域,如HCV的核心蛋白、NS3、NS3 +NS4区^{[ 14, 15 ]} 。为探讨HCV核心区基因在Balb /C小鼠体内的免疫应答情况,邓涛等^{[ 16 ]}将与HCV核心区基因互补的cDNA定向克隆于真核表达载体pcDNA3,经肌肉注射免疫Balb /C小鼠,动态观察发现,追加免疫2周后抗体即可阳转,并持续> 12周。小鼠脾细胞对HCV核心抗原的刺激指数明显高,证实该基因可诱导细胞免疫应答。这种特异性的细胞免疫应答不仅对预防不同株型的HCV感染具有重要意义,而且对慢性HCV感染患者可能具有治疗作用,有望成为慢性丙型肝炎患者一种理想的免疫治疗措施。赵连三等^{[ 17 ]}将NS3蛋白融合入真核表达载体,构建成了HCV核酸疫苗NV2HC /NS3,动物实验显示,该疫苗能成功地诱导机体产生免疫应答,对表达靶抗原的肿瘤细胞定植产生阻抑作用,提高荷瘤小鼠的生存期及生存率,发挥了特异性的免疫治疗效应。

2. 3　反义核酸技术　反义核苷酸包括反义寡聚脱氧核糖核苷酸和反义RNA两种。反义RNA分子在基因表达的调控中具有普遍的意义,它可与其序列互补的靶RNA以碱基对方式结合,阻断其细胞内转运、剪切加工及与核糖体的结合。而且激活内源性的核酶(如RNAse H等)并将其分解,以抑制或阻断某一基因的表达和功能。反义核酸技术已成功地应用于体外HCV感染,使抗HCV的基因治疗取得了许多可喜的成绩。针对HCV的反义寡核苷核酸主要集中在5′非编码区和核心区,周永兴等^{[ 18 ]}应用HCV基因转染细胞模型,以针对上述基因区的反义寡核苷酸已有效地抑制了HCV的复制和基因的表达。王小红等^{[ 19 ]}用反义核酸抑制HCV基因调控,结果显示靶向翻译起始密码下游的反义核酸抑制率可达61%。有报道,能够抑制IRES处病毒复制的起始的硫代磷酸寡聚反义核苷酸,目前已进入Ⅱ期临床实验^{[ 20 ]}。但反义核酸技术也存在许多问题,如寡聚物易降解,细胞摄取效率低,寡聚物的非特异性结合,对mRNA的非特异性阻断等。

2. 4　表位疫苗　采用表位抗原而不是大片段的HCV抗原蛋白作为免疫原,可最大限度地避免HCV抗原蛋白的致癌性及某些表位的免疫抑制作用,同时,也可避免针对不合适位点产生的免疫应答而导致的促进病原体免疫逃逸株的形成或加重感染的程度。因此,设计针对HCV单一表位或多表位的基因疫苗免疫策略更为有利。在研制HCV表位疫苗时要选择高度保守的表位以克服表位变异引起的副作用,而为了增加细胞免疫的强度和广度,以及人类白细胞抗原( human leucocyteantigen, HLA) 的人群覆盖率, 必要时要选用多表位抗原。Urabni等^{[ 21 ]}鉴定了若干HLA-A2、HLA-A3和B7型限制的T细胞表位,此3 个超家族的所有成员几乎覆盖了世界人口> 80%的基因型。这无疑为HCV表位疫苗的研制提供了实验基础。此后,科研工作者们对单表位疫苗如取自NS5A蛋白的一个细胞毒T淋巴细胞表位作为免疫原,及多表位嵌合抗原作为免疫原^{[ 22 ]}。王子来等^{[ 23, 24 ]}构建的3PCX,相继进行了动物实验,证明确可有效增强免疫反应。细胞毒T淋巴细胞介导的免疫反应是清除HCV病毒的关键所在。因此,在丙型肝炎表位疫苗的研究中,寻找更多的保守性CD4+及CD8+细胞毒T淋巴细胞识别表位,重视其细胞毒T淋巴细胞效应有可能使HCV治疗性疫苗研究获得突破性进展。

既往对HCV的治疗以抗病毒、药物保护肝功能和防止病情恶化为主,但疗效欠佳,而基因疗法可从根本上抑制病毒复制、彻底消除病毒,为慢性病毒性肝炎的治疗提供了新的思路。HCV的基因疗法已证实在体外试验和体内模型中,对HCV有明显的抑制作用,但多数研究仍处于试验阶段,要运用于人和临床仍存在一些问题:由于基因突变或同一病毒不同亚型的存在,基因疗法可能诱导病毒变异;细胞内多种酶的存在可能性影响到核酶的活性;体内外RNA 二级结构不一致,直接影响到临床的应用;敏感靶位点的选择,基因传递的肝导向性的精确度,外来基因植入后引起肝细胞的免疫原性变化等仍需进一步研究。如以上问题能寻找到更好的解决办法,则基因疗法有望在临床治疗HCV中发挥巨大的作用,其应用前景极为广阔。