摘　要: 目的　研究皖南地区汉族人群家族性肥厚型心肌病(HCM) 的致病基因β肌球蛋白重链(MYH7) 突变, 并分析基因型与表型的关系。方法　对4个HCM家系先证者的MYH7基因, 经PCR扩增其外显子片段, 用双脱氧末端终止法测序做突变初筛, 对阳性结果患者进行家系调查, 分析其临床表型。结果　在MYH7基因18外显子中发现其中一家系中患者发现Arg663His突变, 另一家系患者发现nt2013c缺失、nt2025C插入, 此为一国内罕见移码突变。结论　MYH7基因可能是皖南地区HCM较常见致病相关基因之一, 其某些突变可在同一家系内遗传并致病, 所致HCM临床症状较轻, 症状出现较晚、进展较慢。同一突变携带者的临床表型存在异质性提示多因素参与了HCM的发生和发展。

家族性肥厚型心肌病( Familial hypertrophic cardiomyopathy , FHCM)主要是一种常染色体显性遗传病,但也有一些常染色体隐性遗传^{[ 1 ]}、X连锁隐性遗传病例的报道。FHC的终身外显率很高,不同年龄的外显率随年龄的增长而上升。近年来的研究已发现至少18种FHC致病相关基因^{[ 2 ]}。β肌球蛋白重链(MYH7)是肌小节的主要成分之一, 30% ～50%的FHC是由MYH7基因突变所致^{[ 3, 4 ]} ,MYH7基因位于染色体14q11 - q12,长23kb,含40个外显子,其中38个外显子参与编码1935个氨基酸,其mRNA长约3kb。MYH73 - 26号外显子区突变发生率较高。对4个无血缘关系的皖南地区汉族FHCM患者MYH7基因3 - 27外显子DNA进行测序,了解皖南地区汉族HCM的MYH7基因的突变位点,致力发现新突变位点,并分析其基因型与表型的关系。

资料与方法

1. 对象: 4个无血缘关系的中国皖南地区汉族FHC的先证者,年龄41 - 54 岁,男性2例,女性2例,每个先证者其家族中至少有两人发病。所有患者临床资料均包括体检、心电图、二维及多普勒超声心动图检查结果。HCM的诊断标准:超声心动图检查室间隔或心室壁厚度≥13mm,排除其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾病(诊断依据WHO /IFFC1996年标准) 。家族内死亡者的基因型由其临床资料及直系子女的基因型来推定。正常对照40例,均为汉族,男17例、女23例,经各项检查排除引起继发性心肌肥厚的疾患,平均年龄49. 1岁。

2. 基因组DNA 提取: 用含2% EDTA - Na2 ( pH 8. 0 )0. 3ml真空试管采血3ml, 5000转/分离心10min,分离出血浆, - 20℃保存。剩余血球混匀,加蒸馏水10min后红细胞溶血,再5000转/分离心10min,弃上清,留取沉淀的白细胞。然后用碘化钾法常规提取白细胞DNA标本,经电泳检测纯度、紫外分光法测浓度,于- 80℃保存。

3. 聚合酶链反应( PCR)扩增基因组DNA:根据文献报道设计MYH7基因3 - 27号外显子的引物,上海生工生物技术公司合成。其中18 号外显子的引物序列为:上游引物, 5′ccctgtctcgccccaggg 3′;下游引物, 5acggaatgtgtagtgggagtaatg 3′。PCR扩增体系50μl,反应体系含基因组DNA250ng,上下游引物( 25pmol/μL ) 各0. 6μl, dNTP (各2. 5mmol/L ) 2μl, 10 ×buffer (Mg2 + p lus) 5μl, Taq p lusDNA聚合酶2U (上海生工生物技术公司) 。PCR 扩增条件: 预变性; 94℃ 5min ; 94℃35 s, 59. 5℃ 35 s, 72℃ 45 s,共30个循环,最后延伸10min。

4. PCR 产物测序:按双脱氧末端终止法进行测序(美国ABL公司3730XL自动测序仪) ,测序引物与PCR引物相同,18号外显子PCR扩增的片段约长443bp。应用18号外显子同一序列引物扩增先证者家系中所有成员的DNA 目的片段,并测序。

5. 突变位点的确定:从pubmed的nucleotide Research提供的正常人β - MHC基因Exon18标准序列来分析测序结果,确定突变位点。