2. 3　蛋白质消化

现代MS仪器虽然能够高精度的测定完整蛋白质分子质量,但仍会发生错误,蛋白质质量越大,其绝对误差值越大。因此将蛋白质消化成质量小的肽片段,能够提高测定的精确性。其方法为从凝胶中切出目的点或条带,脱色,用蛋白酶(通常是胰蛋白酶)消化,蛋白质消化为6～20个氨基酸的肽,洗脱后即可进入MS仪检测。

2. 4　蛋白质分析和鉴定

在分离及检测后,要进行蛋白质的分析和鉴定。目前用于蛋白质分析的主要工具是MS。与传统的氨基酸分析法相比,MS无需纯化蛋白,并可同时鉴定多个蛋白质^{[ 3 ]} 。目前主要应用的方法有:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption / ionization-time of flight mass spectrometry,MALD ITOF MS) 和串联质谱仪( tandem mass spectrometry,MS/MS) 。前者用于分析固体蛋白质样品,后者分析水溶液中的肽段或蛋白质。

分析后的工作就是鉴定蛋白质。肽质量指纹谱(pep tide mass fingerp rinting, PMF)是目前最具代表性的蛋白质鉴定技术。实验测得的蛋白质酶解肽段在蛋白质数据库中检索,寻找具有相似质量的肽,从而鉴定蛋白质。用肽质量指纹谱进行蛋白质鉴定的质量取决于MS数据的质量、数据库的准确性以及使用的检索算法和软件功能。

2. 5　新技术

除传统的2-DE分离技术和MS技术联用的研究策略外,蛋白质芯片技术可直接将血清或其他组织提取物加于芯片上筛选蛋白质,随后以表面增强激光解吸/电离质谱( surface enhanced laser desorp tion / ionization mass spectrometry, SELD IMS)进行鉴定,可高速地进行活性蛋白质组分析。其方便快速高通量的优点使之成为蛋白质组学研究方法中的另一支生力军。另外,蛋白质复合物的纯化、酵母双杂交和噬菌体显示等技术也是目前被采用的蛋白质组学研究方法。

3　心血管疾病蛋白质组学研究进展

蛋白质组学的发展对心血管疾病的发病机理,病变过程的研究更为深入,以下简述几种常见心血管疾病蛋白质组学的研究。

3. 1　扩张型心肌病

扩张型心肌病( dilated cardiomyopathy,DCM)是一种未知病因学的疾病,其主要特征是心室扩张、室壁变薄、心肌收缩期泵功能障碍,产生充血性心力衰竭(心衰) ,是最常见的心脏移植原因。Corbett等^{[ 4 ]}研究证实, 100多种蛋白在DCM患者的心肌组织中的表达有明显改变, 88种蛋白的表达是下降的。改变的蛋白大致可分为3类: (1)细胞支架和肌纤维蛋白,如肌间线蛋白、肌球蛋白轻链-2。该发现与充血性心衰时兴奋-收缩耦联失调相一致。(2)线粒体相关蛋白和与能量产生相关的蛋白质,如ATP合成酶、肌酸激酶。这些蛋白的减少可能是导致心肌收缩力下降的重要原因。(3)应激反应相关蛋白,如热休克蛋白HSP-7。这提示反应应激相关蛋白在DCM的发生发展中有不可忽视的作用。

3. 2　心力衰竭

心衰是多种心脏疾病发展的结果,应用蛋白质组学有助于了解心衰时心肌细胞功能障碍及代偿发生的分子机制。已知临床上治疗心衰的主要手段———血管紧张素Ⅱ受体阻断剂能够降低胞内蛋白激酶C ( PKC)信号传导。因而,研究PKC在心衰中所起的作用将可能会揭示心衰发生的机制。Noguchi等^{[ 5 ]}从衰竭和未衰竭的心肌细胞中分离完整的细肌丝,证明衰竭组织的细肌丝最大收缩力有27%的下降。同时应用蛋白质组学方法研究发现,衰竭心脏与未衰竭心脏组织相比, PKC亚型α、β1和β2表达显著升高(分别193%、55%、124%; P < 0. 001) 。这些数据表明PKC表达变化可能与细肌丝的功能变化相关。鼠的相关实验也证明,衰竭心脏的PKC水平增加直接影响细肌丝的功能。该研究结果在分子水平为该临床治疗方案提供了新的证据。

最新有研究^{[ 6 ]}利用蛋白质组学技术鉴定心衰与未心衰细胞蛋白质变化。从人类左心室组织中分离细胞膜,发现( 1)心肌膜有丰富的伴侣蛋白细胞支架蛋白相关信号转导系统蛋白和酶; (2)心衰细胞膜有30种蛋白明显上升或下调的改变。该研究利用蛋白质组学技术,首次明确了心肌细胞膜蛋白成分和心衰细胞膜蛋白的变化,有助于进一步了解它们在疾病中扮演怎样的角色。