3 酶联荧光分析法

酶联荧光分析法是法国梅里埃公司开发的一种检测新技术(VIDAS cTnI) ^{[ 8]}。其采用了一步夹心与酶联荧光相结合的方法。检测时, 将患者血清样本吸入固相针内, cTnI 与固相针内墙包被的cTnI 单克隆抗体结合, 未结合的cTnI 通过洗涤被除去, 标记ALP 的cTnI 单克隆抗体吸入固相针内, 与待测定的cTnI 捆绑形成结合三明治, 底物4- 甲基伞形酮磷酸盐在固相针内循环进出, 被ALP 催化水解成荧光产物4- 甲基伞形酮,在450 nm 处检测其荧光值。cTnI 含量与扣除本底后的荧光值成正比, 仪器通过多点定标曲线自动计算样本中cTnI 浓度。该方法具有操作简便、自动化程度高、测定快速、结果准确可靠等特点, 检测范围为0.1 ～50 μg /L, CV< 5%, 与骨骼肌肌钙蛋白T( sTnT) 、骨骼肌肌钙蛋白I( sTnI) 和心肌肌钙蛋白C 等几乎没有交叉反应, 15 min 内可得测定结果。

4 胶体金免疫层析法( ICA)

免疫金技术是继放射性同位素标记、酶标记、发光荧光标记之后的又一大标记技术。胶体金由于具有特殊的光学性质和电性质, 例如显色性、导电性和非线性光学特性等, 在免疫分析方面有着其独特的优势。目前, 金标免疫法主要是应用到与免疫层析技术相结合的ICA 中, 该法标本用量少, 简便快速, 适合于cTnI 的床旁检测。国外在这方面的研究相对较多, 如美国的Spectral Diagnostics 公司、德国莱帮公司等都推出了利用ICA 法制备的cTnI 检测卡, 其基本原理均是利用两个cTnI 单克隆抗体的结合来检测cTnI。当血清样本滴到吸收孔内, 第一个被胶体金标记的抗体与cTnI 结合形成一个抗体抗原结合体。第二个固定化的cTnI 单抗捕捉到这个结合体, 产生一个粉红色的颜色带, 相对于无结合体的存在, 反应圈内则没有色带。但基于该方法开发的检测卡, 虽可快速完成检测, 但仅能用于cTnI 定性和急性心肌梗死患者的初选, 临床应用有一定局限性。

5 免疫比浊法

免疫比浊分析属液相沉淀试验, 其基本原理是抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应, 形成小分子免疫复合物, 在增浊剂的作用下, 迅速形成免疫复合物微粒, 使反应液出现浊度,待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。该法根据检测器的位置及其所检测的光信号的不同, 可分为免疫乳胶比浊法( turbidimetry) 、免疫散射比浊法(nephelometry) 等。王永卿^{[ 9]} 报道了免疫乳胶比浊法测定cTnI 的临床应用。该法将cTnI 与胶乳颗粒表面的抗体结合, 导致相邻的胶乳颗粒彼此交联, 进而通过比较反应前后透射光和散射光改变的程度, 达到测定的目的。该法灵敏度可达0.3 ng /mL, 线性范围为0 ～25 ng /mL, 批内CV 值4.0%, 批间CV 值4.7%。李宁沙等^{[ 10]}同样采用了此法检测cTnI, 并比较了不同抗凝剂对检测结果的影响, 发现肝素锂相对于肝素钠、EDTA-K2 而言, 对抗原活性影响最小, 是较为理想的抗凝剂。上述研究证实免疫比浊法相关性好、线性范围宽、精密度高, 具有一定的临床应用价值。

6 金标银染法

金标银染法是Guo 等^{[ 11]} 以硝酸纤维膜作为基底, 结合一步法双单克隆抗体夹心技术、蛋白质芯片技术、纳米金探针技术以及纳米颗粒上的银染放大技术于2005 年建立的一种检测cTnI 的快速测定法。该方法在预先准备好膜基底和免疫金探针的情况下, 能在40 min 内报告测定结果。检测临界值为0.3 ng /mL, 线型范围为0.3 ～42 ng /mL, 批内和批间CV 值均< 20%, 对肌红蛋白、sTnT、sTnI 的交叉反应非常低, 其检测结果与ELISA 法相比较, 两者的符合率为86%。但该方法仅是对cTnI检测进行的初步探索, 尚不成熟, 由实验室真正走向临床,还有较长的道路。

7 质谱分析法

质谱分析技术是近年来蛋白质组学发展中最重要的突破之一, 它具有高效、灵敏、准确、自动化、可同时分析多蛋白混合物等特点。其原理是: 通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子, 然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z 值) 的蛋白质离子分离开来, 经过离子检测器收集分离的离子, 确定离子的M/Z 值, 分析鉴定未知蛋白质。Labugger 等^{[ 12]} 从心肌组织匀浆中分离、提取肌钙蛋白, 并采用亲和色谱法和免疫印迹法等建立肌钙蛋白肽质量指纹质谱图谱, 然后利用质谱分析仪检测急性心肌梗死患者的血清。结果表明质谱分析法可快速证实待测标本中是否存在肌钙蛋白, 并可分析出肌钙蛋白I、T、C 三个亚单位各自所占的比例, 但其只能定性诊断, 不能定量, 尚需进一步探索研究。魏晓真^{[ 13]} 报道了飞行质谱法检测cTnI 的临床研究, 并将该法与cTnI 的快速检测法相比较。该研究表明早期急性心肌梗死患者和正常人之间均存在稳定的蛋白质谱表达, 早期急性心肌梗死患者M/Z 值在8 149.84 的蛋白质呈低表达, 而M/Z 值在5 910.00的蛋白质呈明显高表达。据此, 该法可用于早期诊断急性心肌梗死, 且通过比较证实飞行质谱法的敏感性和特异性均明显优于cTnI 快速检测法。