摘　要: 目的　了解人类免疫缺陷病毒I 型(HIV - 1)B′亚型特异性细胞毒性T 细胞(CTL) 功能与中国HIV - 1感染者疾病进展关系。方法　将覆盖HIV - 1B′亚型Gag p17 、p24 和p2p7plp6 全长的54 个重叠多肽作为抗原,用酶联免疫斑点实验( EL ISPOT) 检测58 例HIV - 1 感染者特异性CTL 对上述多肽的应答情况。结果　中国HIV - 1 感染者特异性CTL 可识别多个HIV - 1B′Gag 表位,反应宽度与病毒载量显著负相关( r = - 0.374 , P = 0.004) ,与CD4 +T 细胞绝对计数显著正相关( r = 0.425 , P = 0.001) ,反应强度与病毒载量显著负相关( r = - 0.285 , P = 0.030) 。长期不进展者识别HIV - 1B′Gag 多肽的反应宽度显著高于无症状感染者和艾滋病患者( P = 0.001 , P = 0.005) 。结论　我国HIV - 1 感染者体内存在识别不同HIV - 1B′Gag 多肽表位的特异性CTL 应答,并且与疾病进展相关。

细胞毒性T 细胞(CTL) 能特异性杀伤病毒感染细胞并分泌IFN - γ等炎性细胞因子,在抗病毒感染的免疫应答中发挥重要作用。国外研究发现,CTL 应答是感染人类免疫缺陷病毒I 型(HIV - 1) 急性期最早能检测到的HIV - 1 特异性免疫应答,对于控制HIV - 1 病毒血症有重要作用,而在HIV- 1 感染慢性期,对CTL 控制疾病进展作用的报道并不一致^{〔1 ,2〕}。国外报告的病例多为非洲和欧美人群,使用的多肽抗原为欧美流行B 亚型、C 亚型、AE 重组亚型等。本室前期用B 亚型多肽抗原对我国感染者CTL 功能检测结果显示,我国HIV - 1 感染者特异性CTL 能够识别不同Gag 多肽,HIV- 1 特异性CTL 功能与疾病进展相关^〔3〕。由于我国主要流行毒株为HIV - 1B′、B′/ C 亚型,与国外主要流行亚型不同,研究中国人群针对国内主要流行毒株的特异性CTL 应答有助于了解我国HIV - 1 感染者的免疫应答特征和细胞免疫在控制HIV - 1 复制、延缓疾病进程中的重要作用,并为研制适用我国人群的疫苗提供实验依据。为此,我们于2006 年1～3 月对58 名HIV - 1 感染者的HIV - 1B′Gag 特异性CTL 应答进行了相关研究,以评价中国HIV - 1 感染者的CTL 功能与疾病进展的关系。

1 　对象与方法

1、1 　对象　由中国医科大学艾滋病(AIDS) 研究所艾滋病确认实验室经蛋白印记试剂盒(新加坡Genelab 公司) 确认为阳性的HIV - 1 感染者58 例。收集HIV - 1 感染者乙二胺四乙酸抗凝全血20 ml ,菲科帕克密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC) 。所有标本均在未接受抗病毒治疗前采集。根据HIV - 1 感染者CD4 + T 细胞数量和感染时间分组。疾病长期不进展者(L TNP 组) :CD4 + T 淋巴细胞≥500 ×106/L ,感染HIV 10 年以上,未经抗病毒治疗,无艾滋病指征性疾病;无症状HIV 感染者(HIV 组) :除L TNP 以外,CD4 + T 淋巴细胞≥200 ×106/ L ,无艾滋病指征性疾病;AIDS 期患者(AIDS 组) :CD4 + T 淋巴细胞< 200 ×106/ L 或有艾滋病指征性疾病。

1、2 　方法

1、2、1 　HIV - 1B′重叠多肽合成　HIV - 1B′Gag 全长的54个重叠多肽(西安联美公司) ,每个多肽长15～22 个氨基酸,相邻多肽间重叠10 个氨基酸。

1、2、2 　酶联免疫斑点实验( EL ISPOT) 测定CTL 应答　采用EL ISPOT 试剂盒(美国BD 公司) 测定。用抗γ- 干扰素- 捕获抗体包被聚偏氟乙烯膜96 孔板,每孔加入100μl 浓度为2～3 ×106/ ml 的HIV - 1 感染者PBMC ,同时每孔加入1 条HIV - 1B′Gag 多肽;阳性对照孔加入植物血凝素作为质控,阴性对照孔加入完全培养基,37 ℃,5 % CO2 孵育20～24 h。加入生物素标记的检测抗体,室温孵育2h 后加入辣根过氧化酶标记的链菌亲和素,1h 后加入底物,30min 后终止反应。经EL ISPOT 分析仪(美国CTL 公司) 读取孔中斑点个数,减去阴性对照孔的数值后根据孔中细胞浓度计算每106 个PBMC中点形成细胞个数(spot forming cells ,SFC) ,结果为点形成单位(spot forming unit ,SFU) 。SFU 高于阴性对照x ±2 s ,且绝对值高于50SFC/ 106 PBMC 以上为阳性。对反应宽度(引起每个HIV - 1 感染者发生特异性CTL 应答的肽段个数) 和反应强度(每个HIV - 1 感染者各个阳性孔中SFU 数值之和) 2项指标进行比较分析。