长期以来，中枢神经系统疾病一直是困扰人类健康的一大难题。神经干细胞（neural stem cells，NSC）的发现为中枢神经系统损伤性疾病的治疗及其伤后功能重建带来了曙光^[1-3]。研究发现，移植到中枢神经系统的 NSC 能够继续存活并迁移、分化，而且成年NSC在体内外均可分化为不同类型的具有生物活性的神经元^[4-5]。因此，体外培养的NSC 移植后在体内的定向诱导分化已成为当前神经科学领域研究的热点，而作为 NSC 移植研究的起点，NSC 的体外培养具有十分重要的意义。本文即对当前国内外的 NSC体外培养方法做一综述。

1 概述

干细胞是指一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。1992 年，Reynolds 和 Weiss[6]在成年小鼠的纹状体中分离出能在体外不断分裂增殖、具有多种分化潜能的细胞，并首次提出了 NSC 的概念。1997 年，McKay^[7]将 NSC 定义为具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。NSC 具有两大生物学特征：自我更新能力和通过不对称细胞分裂的方式分化、产生新生神经元^[8]。现在研究者们普遍认为，无论是在哺乳动物胚胎还是成年个体的脑组织中都存在具有分裂潜能的干细胞，它们能分化为更多的干细胞或多种神经前体细胞，是中枢神经系统内新生细胞产生的源泉。

2 NSC 体外培养方法

2.1 原代取材

NSC 原代取材的常用供体主要为鼠胚胎和成年鼠，供体年龄和取材部位都会对 NSC 的纯度产生影响。鼠胚胎大脑皮质中的NSC数量明显高于新生鼠和成年鼠，而且具有更强的保持未分化状态和进行体外培养扩增的能力，这说明成年鼠体内NSC的分化潜能明显低于鼠胚胎体内的NSC^[9-11]，其中又以胎龄12 ~ 15d左右的鼠胚胎体内NSC的分化能力最强^[12-13]，这也符合NSC在大鼠胚胎第11天生成，第15天数量达高峰，以后逐渐终止分化直至新生个体出生的发育过程^[14]。但目前尚不十分清楚来源于胚胎中枢神经系统与成体中枢神经系统的干细胞生物学特征是否相同。

2.2 单细胞悬液的制备

单细胞悬液的制备方法主要有酶消化法^[15-16]和机械分离法^[17]。对于从大脑皮质中分离获取 NSC 而言，这 2 种方法各有利弊。消化酶消化时间过短对于分离大量细胞无明显效果，不能使神经球分散为单细胞，而延长消化时间虽然可使其分散为单细胞，但又将导致大多数单细胞死亡。另外，所有用于分离 NSC 的消化酶对细胞都具有潜在的损害作用：在NSC表面存在较多的神经生长因子受体，当采用酶消化法获取NSC时，可能会引起细胞表面受损致使一部分受体丢失，而这些受体是 NSC 维持未分化状态的关键因素。吸管吹打的机械方法虽不存在上述缺点，但机械切割作用会使细胞活性受到一定的影响，容易产生杂质和细胞碎片，不利于组织细胞的分离，而且吹打的力度和次数也不易掌控。

为此，有些研究者主张通过一种或多种酶消化结合机械吹打的方法分离细胞并进行原代培养，他们认为短期胰蛋白酶消化后再加以少量机械吹打较为适宜，这样既能分离获得大量细胞，避免引起较多细胞死亡，也不影响细胞的后续培养^[18-19]。Sen 等^[20]尝试用一种新的与 pH 值相关的化学方法分离NSC，结果获取的细胞产量和细胞活力分别是机械分离方法的 0.4 和 0.15 ~ 0.20 倍，而且不影响 NSC 的继续自我更新和长期生长能力，产生的细胞碎片也较少，明显优于酶消化法和机械分离法。另外，在常规培养条件下单独使用机械分离方法时，通过适当控制机械吹打次数可以明显减小其对细胞活性的影响，具体操作为：在清洗后的原代组织中加入1mlDMEM/F12培养基，用1ml移液器尖端抵住培养皿或离心管下壁轻轻吹打10 次，再加入10mlDMEM/F12培养基用10 ml移液管轻轻吹打20次，200目筛网过滤后即可获得状态较好的单细胞^[21]。