2.3 培养条件
NSC 对于培养条件的要求很严格，尤其是培养基的成分。目前，一般多采用含有 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（HEPES）、葡萄糖、NaHCO3、谷氨酰胺以及 B-27 等辅助因子和表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、白血病抑制因子（LIF）等生长因子的 DMEM/F12（1:1）培养基用于 NSC 的体外培养[22]。在体外，NSC 的存活和分裂主要依赖于培养基中神经生长因子和辅助因子的浓度，这二者可根据实验条件和目的适当改变。由于 NSC是在无血清培养条件下进行原代培养，所以原代组织中已分化成熟的细胞将很快死亡而被剔除，而未分化的细胞则被保留下来进入增殖状态。
接种密度是影响 NSC 原代培养的另一个关键问题。与其他细胞相比，NSC 的生长更具有密度依赖性[23]。赵志英等[24]提出 NSC 的最佳接种密度应至少为 1 × 105 个/ml。在细胞存活率相同的情况下，将 NSC 以 5 × 105 个/ml 甚至是 1 × 106 个/ml 的接种密度进行接种，然后在 5% CO2、95% 湿度、37℃ 培养箱中培养将更有利于 NSC 增殖[25]。
NSC 一般在原代培养 3 ~ 4 d 后进行半量换液，这是因为 NSC 的自我更新、激活、增殖和分化主要依赖于周围特殊的微环境，而每个细胞所分泌的细胞因子同样也可以影响周围的其他细胞。采用半量换液的方法可以最大程度地使细胞存活环境保持不变，利于细胞生长。
原代培养的 NSC 通常呈球状悬浮生长，NSC 球贴壁将严重影响细胞生长。据报道，利用琼脂糖凝胶包被培养瓶能有效防止 NSC 球的贴壁聚集[26]。
2.4 传代方法
传代培养是利用培养细胞进行各种实验的必经过程，不同的细胞应采取不同的方法进行细胞传代，正确的传代方法是保证 NSC 继续生长增殖的重要因素。随着 NSC 球体积的增大，中心的 NSC 很容易因缺乏营养而坏死，因此需要在 NSC 球生长到一定体积时（一般在原代培养 5 ~ 7 d时[17]）进行传代。传统的胰蛋白酶消化传代法对细胞表面的损伤较大，容易导致传代后细胞丢失以及存活细胞增殖缓慢。为此，Kim 和 Morshead[27]尝试在原代培养 5~ 7d的NSC 球中加入少量 DMEM/F12（1:1）培养基后，机械吹打 40 ~ 50 次，再重悬于含有 20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF的 DMEM/F12（1:1）全培养基中进行传代培养，结果获得了具有较强活性的 NSC，但同样存在上述的细胞碎片等问题。另外，Sen 等[28]发现采用连续传代法传代的细胞其细胞数和细胞活性也都比较理想。
2.5 细胞增殖
NSC 的细胞周期较长、增殖缓慢，这为短期大量扩增细胞用于移植实验带来了很大的困难，因此，多年来人们一直在探索促进 NSC 增殖的最为有效的方法。Sen 等[28-29]创立了一种大规模扩增 NSC 数量的传代培养方法，他们将原代培养的 NSC 球的平均直径控制在 150 μm 左右，避免NSC 球中心细胞发生坏死，然后将 NSC 球置于悬浮生物反应器中培养，在 12 d 内传代 3 次，结果细胞数扩增了近 3000 倍，细胞密度达到 1 × 106 个/ml，活细胞比例达80% 以上。Low 等[30]将 EGF 反应性鼠 NSC 采用旋转管培养法培养 3 d 后，形成了肉眼可见的细胞三维复合物，其细胞数是传统固定培养瓶培养细胞数的数十倍。还有学者将采用有限稀释法挑选的 NSC 球通过亚克隆连续传代法进行大量扩增，也获得了纯度高且数量充足的 NSC[31-32]。另外，在原代培养时每天添加定量、新鲜的生长因子，也有助于 NSC 的快速增殖[21]。
3 小结
总之，更好地掌握 NSC 的体外培养方法将有望为人们今后深入研究和使用 NSC 提供有力的实验手段和丰富的细胞来源，也将为进一步研究 NSC 的生物学特性用于治疗神经系统损伤性疾病提供一种新的方法。现在 NSC 的体外培养方法已渐趋成熟，但仍然存在诸多的问题：①添加细胞营养成分能否改善体外培养的 NSC 贴壁率随时间逐渐增加的趋势[33]；②如何确定以差速法去除杂质细胞的具体时间；③目前的体外培养环境能否导致细胞突变等等，还有待于我们进一步探索和研究。
