弓形虫( Toxoplasma gondi i ) 是一种可寄生于多种宿主、引起人兽共患弓形虫病的专性细胞内寄生原虫。该病呈世界范围流行,全球约1/ 3 的人受感染^〔1〕,严重危害人类健康。同时,弓形虫病给畜牧业生产带来巨大损失。大量调查表明,近2 年来我国大范围地区普遍发生的猪繁殖性疾病,是猪病毒病如蓝耳病、猪瘟、伪狂犬病、乙脑等和弓形虫感染共同作用的结果^〔2-3〕。动物弓形虫病的流行和传播导致了人弓形虫病的流行和高发。研究弓形虫入侵和毒力相关因子,对于寻找有效的药物作用靶位点和疫苗候选分子,预防和控制这种社会性寄生虫病具有重大意义。弓形虫的入侵和对宿主的毒力机制是多种因素共同作用的结果。本文对弓形虫入侵和毒力相关因子的研究进展做一综述。

1 　弓形虫主要分泌细胞器分泌的入侵和毒力因子

弓形虫主要含有3 类分泌细胞器, 即微线体(microneme) 、棒状体( rhopt ry) 和致密颗粒(dense granule) 。在虫体与宿主细胞接触早期,微线体蛋白(microneme protein ,MIC) 最先从速殖子顶端排泄,通过识别宿主细胞膜上的受体对其进行粘附,在虫体入侵宿主细胞早期阶段发挥重要作用。随后,棒状体蛋白也从速殖子顶端释放,参与纳虫空泡形成。最后, 致密颗粒蛋白分别从虫体顶端、侧面及后面分泌进入纳虫空泡,最终与纳虫空泡膜或膜内微管网络关联,完成对纳虫空泡的修饰,抵抗了宿主细胞溶酶体的裂解和酸化,隔离了宿主的内吞噬作用,使弓形虫能够顺利从宿主细胞内获取营养并大量增殖。

1. 1 　与虫体入侵和毒力有关的微线体蛋白　目前已知的微线体蛋白有15 种以上^〔4〕,包括MIC1-MIC12 、AMA1 、Tg-SUB1 、Tg-SUB2 等,大多含有类似真核细胞黏附分子的保守结构域,如血小板结合蛋白样结构域( thrombospondinlikedomain , TSP) 、整合素A 样结构域( integrin A-like domain) 、表皮生长因子样结构域( EGF2like domain) 、几丁质连接样结构域(chitin binding2like domain ,CBL) 和苹果样基序(apple motif) 等。微线体通过配体结构域,可与多种宿主细胞受体结合,解释了弓形虫能入侵多种细胞的原因。MIC1蛋白序列含有18 个半胱氨酸,形成与宿主细胞表面结合的半胱氨酸区^〔5〕。mic1 基因缺失将降低弓形虫对成纤维细胞的入侵能力,但此基因缺失株对接种小鼠的毒力并无多大影响^〔6〕。

微线体蛋白MIC2 属于血小管反应蛋白相关匿名蛋白( thrombospondin related anoymous proteins , TRAP) 家族,相对分子量为95～100kD ,主要利用粘附素-A 结构域和6个连续TSP-1 识别宿主细胞膜上的粘多糖。而MIC2 相关蛋白M2AP 不含可识别的粘附性结构域。在内质网生成MIC2 与M2AP 的15min 内, 两者按1 ∶1 的比例形成约450kD 的异源六聚体,内含3 个αβ结构,以稳定的复合体形式发挥作用。用mic2 基因敲除的弓形虫虫株感染宿主细胞后,M2AP 蛋白出现运输错误。mic2 敲除株对宿主细胞粘附和入侵能力比野生株降低50 % ,虫体螺旋式滑动的能力也大大下降。同时发现在接种MIC-2缺陷型弓形虫的小鼠的感染部位,荷虫率和炎性免疫反应较低,能够诱导小鼠产生较长时间的免疫保护能力^〔7〕。将m2 a p 基因敲除会导致MIC2 滁留在内质网/ 高尔基体中,严重影响弓形虫对宿主细胞的入侵能力^〔8〕。

MIC3 蛋白是一个富含半胱氨酸的395 个氨基酸残基的多肽,具有一个几丁质连接样结构域(CBL) 。此结构域含8个形成二硫键的半胱氨酸和几个高度保守的芳香族残基,保证了蛋白结构的正确折叠和与宿主细胞膜上N-乙酰葡萄糖胺的结合。Cérède 等发现mic3 缺失并不影响虫株对成纤维细胞的入侵能力,但把MIC3 的CBL 结构域的126 位色氨酸替换成甘氨酸(W126A) ,128 位苯丙氨酸替换成甘氨酸(F128A) 后,突变株对小鼠的毒力显著下降:在感染40d ,攻虫小鼠的存活率分别为83. 3 %和95 %。表明MIC3 的CBL结构域与弓形虫毒力密切相关^〔6〕。

在弓形虫入侵过程中, 微线体蛋白相互协同, 形成MIC1/ 4/ 6 复合体、MIC3/ 8 复合体以及MIC2/ M2AP 复合体。MIC6 负责护送MIC1 和MIC4 到微线体, MIC8 是MIC3 的护送蛋白。护送蛋白帮助可溶性MIC 折叠成具有生物学功能的正确构象,促进MIC 的运输和释放。

AMV1 蛋白在包括疟原虫在内的众多复顶亚门原虫中相当保守,是疟原虫疫苗的候选抗原之一。敲除AMV1 蛋白基因,可导致弓形虫对宿主细胞的侵袭能力显著下降。虽然AMV1 蛋白缺失不影响虫体早期的滑动、微线体蛋白的分泌以及对宿主细胞的粘附行为,但缺失株虫体表现出棒状体蛋白分泌受阻,说明AMV1 蛋白可通过调控棒状体蛋白的分泌来影响虫体对宿主细胞的入侵^〔9〕。

TgSUB1 具有枯草菌素蛋白酶样-丝氨酸蛋白激酶结构,依赖钙调机制发挥酶解作用。众多弓形虫的入侵相关蛋白在分泌和运输前均以前体的形式出现。据推测TgSUB1可能酶解部分微线体蛋白如M2AP、MIC5 等以及部分表面抗原的前体和宿主蛋白〔10-11〕。TgSUB2 也是枯草菌素蛋白酶样丝氨酸蛋白激酶,并始终参与了弓形虫生活史的重要过程。TgSUB2 对ROP1 、ROP2 、ROP4 、ROP8 以及ROP18 的前体均具有自发性的酶解作用,故而与棒状体蛋白的成熟和靶向分泌有关。TgSUB2 蛋白在ROP1 的酶解位点在氨基酸序列位点SFVE 之后,而对ROP2 、ROP4 、ROP8 的酶切位置尚不清楚^〔12-13〕。通过对入侵相关蛋白的修饰, TgSUB1 和TgSUB2 影响了弓形虫对宿主细胞的入侵过程。