虎义平1 , 刘 君2 , 汤谷平2.
(1. 江西农业大学理学院, 江西南昌 330045; 2. 浙江大学化学系, 浙江杭州 310028)
摘要: 作为非病毒转基因载体骨架组件,功能性多肽在构建转基因载体、载体的核转运和靶向运送等方面发挥着重要作用。本文综述了多肽在药物靶向运送和疾病治疗中的研究进展。
1 前言
随着人类基因组序列分析和功能蛋白组学工作的展开,越来越多的研究者发现在生命活动中(如分子识别、信号转导、细胞分化及个体发育等)起着决定性作用的不是那些分子量大、结构复杂的蛋白质体系,而是结构相对简单的小分子多肽物质[ 1 ] 。如何利用分子生物学、基因工程、纳米技术等使不同功能活性的多肽充分被人类利用,已受到许多研究者的关注。短肽研究的热点是其在药物靶向载体和疾病治疗中的应用,药物载体能够有效地控制药物在体内的释放和有效转运到病变部位[ 2 ] 。利用组织解剖学与生理学的方法,结合载体的物理化学与生物学特性,可对载体进行有效地定位。
2 生物活性多肽的功能
基因治疗的关键是如何将目的基因有效地导入到靶细胞中去,其主要依赖于高转染效率和特异靶向性的载体。基因载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。非病毒载体具有携带目的基因容量大、免疫原性低、无恶性转化可能及大规模制备容易等优点,受到研究人员的关注, 但非病毒载体系统的转染效率较病毒载体系统低[ 3 ] 。为了达到理想载体的要求,需要对非病毒转基因载体进行一系列的修饰,达到提高转染效率和靶向功能的目的。因此在修饰过程中,具有不同功能活性的各类型多肽也发挥了关键作用,这些多肽的功能涉及如下环节(图1) :(A)多肽与DNA结合形成复合物保护DNA; (B)多肽/DNA复合物与特定细胞表面配体结合或通过内吞作用进入细胞; (C)多肽/DNA复合物进入细胞后破坏内涵体膜; (D)多肽/DNA复合物转运入核。此外,多肽研究的另一个热点是其在疾病治疗方面的应用。本文就近年来各类型多肽作为转基因载体组件和在疾病治疗中的研究进展作一综述。
211 转基因载体骨架的构建
富含碱基的氨基酸多肽均可用作与DNA结合形成转基因载体骨架。如多聚赖氨酸( PLL ) 、精氨酸、组氨酸、聚L 2天冬氨酸、鱼精蛋白等,其中以PLL应用较多[ 4 ] ,这是因为PLL在生理pH时,大部分氨基质子化,从而携带正电荷,可以通过静电吸引作用,结合带负电荷的质粒DNA或者寡核苷酸形成纳米级颗粒,从而通过细胞的内吞作用进入细胞。如Marshall等[ 5 ] 用富含精氨酸多肽( RXR ) 4 ( RXR2RXRRXRRXRXB)转运反义RNA 链进入小鼠的免疫细胞,间接地结合目的RNA,改变其基因表达模式,该多肽提高了白细胞对此低聚物的吸收和靶向作用。Kichler等[ 6 ]发现富含组氨酸的多肽链LAH4(KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA ) 能有效地转运DNA复合物进入哺乳动物的细胞,体外转染实验表明其有很好的转染效率。
大部分基因载体是通过内吞作用转运,但是这样会增加药物酶解,在细胞质中释放量较少[ 7 ] 。多肽作为载体具有转运效率高,毒性低,体内外均可应用,对所载物质的大小无明显限制,不引起炎症反应,对进入细胞的物质的量可有效控制,使其保持在生理浓度范围等优点,从而在药物运载领域得到广泛的应用[ 8 ] 。如Muratovska 等[ 9 ] 为了研究siRNA在哺乳动物细胞内的功能,将siRNA经二硫键结合了转运多肽(CL IKKALAALAKLN IKLLYGASNLTWG)和细胞透膜敏感肽(CRQ IKIWFQNRRMKWKK) ,提高了其在细胞质环境的稳定性和细胞对其的吸收,并增强了其在细胞内的稳定表达。Moriguchi等[ 10 ]发现PLL能够缩合siRNA并将其转入细胞,且观察到了相应基因功能的沉默。
212 信号启动与核定位信号
多肽信号是重要的胞间信号感应分子,肽的终端配位基可与组织特异受体结合,在生理作用下可被其他分子识别,刺激组织应答反应,从而调节动、植物的机体防御和发育过程。载体DNA复合物中的DNA必须进入细胞核才能有效转录和翻译出目的蛋白,发挥相应的功能。细胞核包含了相应的结构和蛋白来调节细胞内物质的进出核,真核细胞的核孔复合物结构允许小分子物质自由通过,而大分子的物质则需要能被胞浆转运受体识别的转运分子协助,这种转运分子被命名为核定位信号(NLS) 。提高DNA进入细胞核的量可以提高目的基因的表达量。Suk等[ 11 ]将来自H IV病毒的核定位信号肽H IV21Tat ( YGRKKRRQRRR)利用聚乙二醇做中间分子与聚乙烯亚胺( PEI)复合后,在分化的SH2SY5Y细胞中比无偶联信号肽的载体转染效率高14 倍。如GALFLGFLGAAGST2MGAWSQPKKKRKV是来自猿病毒40 大T抗原的碱性片段,属于核定位信号序列,可以介导亲核蛋白与转入子α结合,形成的复合物再触发结合siRNA在细胞作用下进入细胞核,发挥基因治疗作用。
213 细胞膜破坏效应
由于多肽物质在穿越生理膜屏障的过程中具有水溶性低、稳定性差以及渗透性差等缺点,阻碍了生物活性多肽的应用。为了提高水溶性,可在多肽中导入具有生物可逆性的离子官能团,从而提高多肽药物的极性与水溶性;为了提高生物膜的渗透性,可提高多肽的亲酯性质,以促进其被动渗透。两性分子阳离子多肽KALA (WEAKLAKALAKALAKHLA2KALAKALKACEA)能够结合DNA基因复合物,并能穿透多种细胞膜, 促进复合物的吸收[ 12 ] 。Mano等[ 13 ]研究发现, 细胞膜渗透肽S4132PV (ALWK2TLLKKVLKAPKKKRKV)能较快地穿透活细胞膜且对细胞毒性很小。
蜂毒肽( CIGAVLKVLTTGLPAL ISW IKRKRQQ )是一种来自于蜂毒的多肽[ 14 ] ,在液相中能够形成两性分子α2螺旋,通过C端阳性负荷簇(KRKR)与体内脂膜通过静电相互作用,插入体内脂质双层中,破坏生物膜结构,导致脂膜破裂。Boeckle等[ 15 ]将蜂毒肽的C端偶联于PE I上,与单纯PE I相比,转染效率在小鼠结肠癌细胞(CT226)中提高了160 倍,在初级内皮细胞中提高了100倍,机制与蜂毒肽插入内膜有关,但也发现,如果将蜂毒肽通过N端与PEI偶联,其对膜的破坏并非通过插入机制来完成。
