[摘　要] 　目的: 通过对大鼠肾小球系膜细胞(MsC)转染Sm ad3基因,观察转染阳性细胞克隆尿激酶型纤溶酶原激活物( uPA)及纤溶酶原激活物抑制因子21 ( PA I21)表达的改变,以进一步阐明转移生长因子2β( TGF2β)介导肾小球硬化发生的作用机制。方法: 经脂质体介导将含有Sm ad3重组表达质粒转染大鼠MsC,用G418筛选及RT2PCR,West2ern blot法鉴定;又分别采用RT2PCR与Western blot法,检测转染阳性细胞克隆uPA及PA I21表达改变。结果: 成功建立高表达Smad3的阳性MsC克隆( Th28, Th215) ,并证实其uPA mRNA及蛋白表达明显降低,而PA I21 mRNA及其蛋白的表达显著增加。结论: TGF2β可能通过上调Smad3而减少组织内uPA的生成和增加PA I21的合成,从而促进肾小球硬化的进展。

大量研究表明,转化生长因子2β ( transforminggrowth factor2β, TGF2β)的作用是介导肾小球硬化发生的共同通路^{[ 1 ]} 。TGF2β通过与靶细胞膜上的相关受体( Tβ2R)结合,磷酸化激活信号转导分子Smad2和Smad3后与Smad4形成异聚体转移至核内,并在核内相关因子的共同作用下,参与对一些靶基因表达的调节^{[ 2 ]} 。体外培养的肾小球系膜细胞(mesangial cell,MsC)有Smad2, Smad3和Smad4存在,可被TGF2β1激活并参与纤溶酶原激活物抑制因子21(p lasminogen activator inhibitor21, PA I21)及Ⅰ型胶原的转录过程^{[ 3, 4 ]} 。最近我们运用细胞转基因技术发现Smad7介导了肾小球MsC基质降解酶系统代谢过程,且其可能为阻止肾小球硬化发生的重要机制^{[ 5 ]} 。本实验将Sm ad3 cDNA重组质粒经脂质体介导转染大鼠MsC,观察转基因MsC克隆尿激酶型纤溶酶原激活物( urokinase2type p lasminogen activator,uPA)及PA I21的表达,以进一步阐明TGF2β介导肾小球硬化发生的作用机制。

1　材料和方法

1. 1　重组Smad3真核表达质粒的鉴定与超纯质粒的制备pcDNA3. 02Smad3 (日本Dr. Takeshi Imamuna馈赠)经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及EcoR Ⅰ单酶切鉴定,送测序(联合基因公司)后大量扩增, Q IAGENKit纯化。

1. 2　Sm ad3基因对MsC转染和阳性细胞克隆的筛选

实验用MsC为第8代,其制备及鉴定可参阅已报道的常规方法^{[ 6 ]} 。融合生长的细胞以1 ×106 细胞数转入6 孔板内,到呈现30% ～50%融合生长时,弃完全培养液,分别加含有L ipofectin ( Gibcobrl公司) 和pcDNA3. 02Smad3 或Lipofectin 和pcDNA3. 0混合液的无血清培养液( Sigma公司) 1 ml, 20 h后弃无血清培养液,加入含20%血清的完全培养液, 72 h后再改用含G418 ( 600 μg/ml,Gibcobrl公司)的完全培养液。20 d后克隆形成,将其种入24孔板中,直至生长至融合,再转入6孔板,最后转入100 ml培养瓶中。

1. 3　对含有Smad3MsC克隆的鉴定

1. 3. 1 　RT2PCR 法　阳性克隆细胞生长至亚融合时,用Trizol (Gibcobrl公司)抽提总RNA,反转录成cDNA ( Promega 公司) ,等量cDNA 依照AdvantagecDNA PCR kit ( Clontech 公司) 提供的步骤进行PCR。其引物如下:内参照GAPDH (上游5′2 ACCA2CAGTCCATGCCATGCCATCAC23′; 下游52CCAC2CACCCTGTTGCTGTAG23′,预计扩增片段长度为450bp) 。Smad3 (上游5′2 TCTTGTGTCTAAGAGAGTTGA23′; 下游5′2 TCCAGTCCAGGAGAAAGGCAC23′,预计扩增片段长度为363 bp) 。

1. 3. 2　Western blot法　阳性细胞克隆生长至亚融合时,弃完全培养液, PBS洗2次, 20μl蛋白依标准方法进行8% SDS2PAGE 变性电泳, 转移至PVDF膜。一抗为山羊抗小鼠Smad3多克隆抗体( 1∶200,Oncogene 公司) , 二抗为生物素化兔抗山羊IgG(1∶500,ABC Kit) 。

1. 4　RT2PCR法检测uPA与PA I21 mRNA阳性细胞克隆生长至亚融合时,用Trizol ( Gibcobrl公司)抽提总RNA,反转录成cDNA ( Promega公司) , 等量cDNA 依照Advantage cDNA PCR kit(Clontech公司)提供的步骤进行PCR。PCR引物如下: 内参照GAPDH 同上。uPA (上游5′2 AATC2GAACTGTGGCTGTC23′; 下游5′2 ATCCCTCTTTCTTCTCAAGG23′,预计扩增片段长度为406 bp) 。PA I21 (上游5′2 CCTCTCCGCCATCACCAACA23′;下游5′2TGTGCCGCTCTCGTTCACCT23′,预计扩增片段长度为261 bp) 。

1. 5　Western blot法检测uPA与PA I21蛋白阳性细胞克隆生长至亚融合时,弃完全培养液,PBS洗3 次,取20 μl蛋白依标准方法分别作8%SDS2PAGE变性电泳,转移至PVDF膜。一抗分别为鼠抗人uPA多克隆抗体(1∶200,复旦大学朱运松教授馈赠)及鼠抗人PA I21单克隆抗体( 1∶200, Oncogene 公司) , 二抗分别为生物素化马抗鼠IgG(1∶500,ABC Kit) 。

1. 6　定量和统计分析

用Kodak Digital Science 1D测定条带的积分光密度,经SPSS 9. 0统计软件对数据进行标准差计算和t检验。