2　结　果

2. 1　重组真核表达质粒pcDNA3. 02Smad3的鉴定经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及EcoRⅠ单酶切鉴定,证明Sm ad3基因已被正确地重组至pcDNA3. 0载体中(图1) ,其两端测序结果显示,与基因库中大鼠Sm ad3序列完全一致。

1:DNA标记物; 2: pcDNA3. 02Smad3经单酶切显示6. 7 kb的条带;3: pcDNA3. 02Smad3经双酶切显示1. 3 kb cDNA及5. 4 kb质粒载体两条带
图1　重组真核表达质粒pcDNA3. 02Smad3的鉴定

2. 2　转染Smad3 cDNA 的MsC鉴定转染的MsC经G418 筛选后,共获得32 个克隆。RT2PCR结果显示, Th28 与Th215 阳性细胞克隆Smad3 mRNA的表达显著增高(图2) 。Westernblot结果显示, Th28与Th215细胞克隆Smad3蛋白表达明显增高,显示相对分子质量约为48 000蛋白条带(图3) 。

1: DNA标志物; 2:正常MsC; 3:转空载体MsC; 4: Th28; 5: Th215
图2　RT2PCR检测Smad3 mRNA结果

1:正常MsC; 2:转空载体MsC; 3: Th28; 4: Th215
图3　Western blot检测Smad3蛋白的结果

        2. 3　阳性MsC克隆uPA mRNA与蛋白表达的改变经RT2PCR检测, Th28 与Th215 细胞克隆uPAmRNA的表达明显降低(图4) 。Western blot结果显示,其uPA蛋白表达比对照组降低约48% ,其相对分子质量为50 000 (图5) 。

1:正常MsC; 2:转空载体MsC; 3: Th28; 4: Th215; 5: DNA标志物
图4　RT2PCR检测uPA mRNA结果

2. 4　阳性MsC克隆PA I21 mRNA与蛋白表达的改变
        经RT2PCR检测, Th28与Th215细胞克隆PA I21mRNA的表达明显增加(图6) 。Western blot结果显示,其PA I21蛋白表达比对照组高约2. 3倍,其相对分子质量为45 000 (图7) 。

1:正常MsC; 2:转空载体MsC; 3: Th28; 4: Th215
图5　Western blot检测uPA蛋白的结果

1:正常MsC; 2:转空载体的MsC; 3: Th28; 4: Th215; 5: DNA标志物
图6　RT2PCR检测PA I21 mRNA结果

1:正常MsC; 2:转空载体MsC ; 3: Th28; 4: Th215
图7　Western blot检测PA I21蛋白结果