3 骨髓间充质干细胞与神经组织的修复

3.1 骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

Aziz^[14]将人MSCs 细胞悬液注射到大鼠纹状体, 72 天后发现植入的细胞约有20%在大鼠脑中存活并迁移至其他脑区, 迁移路径和神经干细胞及星形细胞的迁移路径相同, 即广泛分布于脑中。移植的MSCs 不再表达Ⅰ型胶原, 纤维连接蛋白( fibronectin) 的表达也明显降低, 显示MSCs 移植后失去骨髓基质细胞在培养中的典型特征而形成星形胶质细胞的许多特征。Kopen 等^[15]研究同样表明体外培养的骨髓基质细胞可在小鼠脑中存活并迁移, 此外他认为脑组织中分泌的FGF- 2 能促进MSCs 的增殖, 分泌的神经营养因子能作用于MSCs 的神经生长因子的受体NGFR, 促进其向神经细胞分化。Prille 等^[16]用激光共聚焦显微镜观察GFP 标记的MSCs 移植到脑组织后的变化。实验显示l～6 月时脑内的GFP 阳性细胞较少, 但移植15 个月后发现小脑中有GFP 阳性的成熟的浦肯野细胞( purkinje cells) , 表达Y 氨基丁酸(GABA) 合成酶和谷氨酸脱氢酶, 表明细胞中有神经递质的合成。Corti 等^[17]检测骨髓移植后移植细胞在脊髓内表达神经细胞表型的能力。实验将转染GFP 基因的小鼠骨髓细胞通过尾静脉注射移植到放射线照射后的小鼠中, 3 个月后受体小鼠的外周血中70%的单核细胞GFP 阳性, GFP 细胞在脊髓内广泛分布于白质和灰质的血管周围以及软脑膜下, 多数细胞表达小胶质细胞标志Mac- l 和F4 /80, 少数细胞表达易形细胞标志GFAP 和神经元标志NeuN, NF, Tujl。DNA 指数分析表明以上双标细胞有一个细胞核, 没有出现细胞核融合。此实验中, 脊髓未受损伤, 所以脊髓内移植的细胞数和表达神经细胞标志的细胞数较少。脊髓损伤后, 由于血脑屏障的破坏和损伤局部环境的作用, 向局部迁移的细胞数和表达神经细胞标志的细胞数将增多。

在体外MSCs 分化成神经元的研究中, 只有一个研究提供了强有力证据证明体外诱导MSCs 分化的神经元具有功能活性。Kohyama J 等^[18]用另外两种方法诱导骨髓MSCs 分化成神经元。一种是诱导培养基含有10 mol/L 5- 氮胞苷(5-azacyt idine, 5- A za- C) 神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、BDNF 和神经营养蛋白NT3。MSCs 被诱导96 h 后, 培养基被换以添加了HLA- B27 的DMEDM /F 12 培养基, 其中也含有NGF、NT - 3 和BDN F。另一种是使用神经元诱导剂noggin。2 种方法都诱导骨髓MSCs 分化成神经元, 这些神经元形成轴突, 表达神经元特异的标记, 并开始对去极化刺激起反应, 表明MSCs 被有效地诱导成具有功能的神经元。

这些结果表明MSCs 经过诱导可以分化成神经细胞,并可获得成熟神经细胞的机能, 而且由于MSCs 易增殖, 这样可以构成丰富、易获得而且是可以自体移植的细胞库来治疗许多种神经系统疾病。

3.2 骨髓间充质干细胞与神经损伤修复

发现MSCs 能诱导成为神经细胞后, 研究者就开始尝试用MSCs 移植治疗脊髓损伤。Chopp 等^[19]用NYU 法制作大鼠脊髓损伤模型, l 周后将含2.5 ×1.05BrdU 标记的MSCs 细胞悬液4 μl 在5 min 内注射到脊髓损伤中心处, 对照组用PBS注射。用BBB(Bass- Beattie- Bresnehan) 评分法分析脊髓功能恢复情况, 术前正常值为21 分, 脊髓挫伤后为0~6 分。对照组逐渐自然恢复到11.5 分, 但是到第3 周后即为平台期, 以后恢复缓慢。实验组注射MSCs4 周后恢复到15.3 分, 而且未出现平台期, 继续呈好转趋势, 到4 周时大鼠四肢运动协调,可支撑身体重量。免疫组化发现损伤脊髓移植MSCs 后, 脊髓室管膜细胞、胶质细胞和脉管系统表达Nestin 增加, 脊髓室管膜细胞由单层细胞增殖为多层细胞。免疫双标技术表明植入的MSCs 表达神经元标志NeuN。Chopp 分析MSCs 植入促进脊髓损伤恢复可能的作用机制, 认为一方面有可能移植的MSCs 整合到神经组织并替代受损神经细胞, 另一方面移植的MSCs 被脊髓损伤后的局部微环境诱导, 表达多种能促进神经恢复的因子, 促进室管膜细胞等的增殖, 增强脊髓的内源性的修复能力。

Koshizuka 等^[20]利用造血干细胞( hematopoietic stem cell,HSC) 移植治疗脊髓损伤, 也取得了一定的效果。实验从骨髓中分离出Lin- cKit+Sca- l 造血干细胞, 制作脊髓压迫损伤模型, l 周后将10 000 个HSCs 注射到脊髓损伤中心, 5 周后小鼠后肢运动功能评分移植组为4.2, 较对照组( =2.9) 增高。移植的HSCs 表达O4( 少突胶质细胞标志) 、GFAP 和nestin, 没有表达神经元标志。移植的HSCs 均为单个细胞核, 没有和脊髓内的细胞发生融合。

有实验证明MSCs 也可以在体外向雪旺细胞转化, 移植到外周神径后可以修复神经病变。Sasaki 等^[21]将MSCs 用β-ME 诱导胚胎干细胞向神经细胞分化, 实验发现未诱导的MSCs 表达少量P75 和S- 100, 不表达GFAP 和O4; 诱导后的MSCs 呈现雪旺细胞样外形, 表达p75、S- 100、GFAP 和O4。实验将诱导后的MSCs 和基质材料Mndgil 混合, 浓度为(l～2)×107/ml, 注射到中空纤维管中, 缝合到大鼠切断的坐骨神经上, 3 周后有神经纤维再生和髓鞘形成, 有朗飞结和基底层( basa iaminae) 形成, l 周后神经纤维再生2.2 mm, 3 周后达到8～10 mm; 用未诱导的MSCs 移植, 3 周神经纤维再生为2.5mm; 只用基质材料无神经再生。移植的MSCs 表达GAP- 43、髓鞘相关糖蛋白(myclin associated glycoprotein, MAG) 和MBP。Cuevas 等^[22]也研究了MSCs 移植到切断的坐骨神经后的作用。试验将大鼠的坐骨神经切断, 然后立即缝合神经断端, 在远端注射5 μl 含50 000 个MSCs 的细胞悬液, 单纯显微缝合未移植MSCs 作为对照。术后18 d 与术后33 d 移植组坐骨神经功能指数分别比对照组提高36%和78%。术后33 d 对照组( 共10 只) 中有7 只出现不同程度的自残( autotomy)后脚、趾的感染和水肿, 移植组无自残现象。移植组神经近、远断端间连接好, 断端间出现纵向紧密排列的雪旺细胞样细胞, 移植的细胞有5%表达S- 100, 并从移植处向周围迁移8 mm。由于雪旺细胞比较难以取材和纯化, 在体外要扩增到适当的数量需10 周时间, 所以用MSCs 代替雪旺细胞移植治疗外周神经损伤有一定的适用价值。