3 T- bet 测定方法

T- bet 测定方法主要有两种：（1）免疫印记法测定细胞浆及细胞核内T- bet 水平即蛋白水平测定；（2） 实时荧光定量PCR（RQ- PCR）检测T- bet mRNA表达即基因水平测定。Elena 等^[3]用Ficoll 密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMCs），随后使用免疫磁珠法进一步分离纯化T 细胞，在T 细胞中加入佛波酯和Ca2+ 载体离子霉素促使T 细胞体外活化并在加入蛋白酶抑制剂后收集胞浆裂解物上清液，进行胞浆T- bet 测定；同时收集细胞核裂解物上清液，进行胞核内T- bet 测定。RQPCR法是在获取外周血单个核细胞后采用Trizol 试剂进行一步法抽提PBMCs 总RNA，配置相应的反应体系，使用RNA 进行cDNA 合成，并最终用于RQ- PCR 反应。

4 T- bet 表达与再障的关系

再障的免疫病理过程主要表现为Th1 细胞反应，反应程度与其造血衰竭程度相关，说明再障是一种以Th1漂移为中心的免疫介导性疾病，T- bet 功能和细胞因子的改变在很多疾病中扮演重要角色，但T- bet 在再障发病机制中的作用目前研究极少。已有的研究表明，再障患者T 淋巴细胞中T- bet 表达异常增加，而且与正常对照者相比，无需预先活化，再障患者T- bet 可以直接与IFN- γ 基因启动子前端结合，导致IFN- γ 基因转录激活，并进而使IFN- γ 表达增加和发生Th1 漂移^[3]。除此之外，T- bet 与再障疾病活动、对免疫抑制治疗的反应有关。经以环孢素A/ 抗胸腺细胞球蛋白（CsA/ATG）为核心的免疫抑制治疗，获得缓解的再障患者T- bet 表达降低，与正常对照者相比无显著性差异，但疾病复发时，T- bet 表达再度升高^[4]。再障患者T 淋巴细胞产生过多的IFN- γ、IL- 2、TNF，提示造血干细胞损伤是由Th1 细胞过度反应所致。Kakagianni^[12]研究提示，再障患者发病不仅与Th1 细胞及Th1 型效应细胞和效应因子增高有关，而且还与Th2 细胞代偿及Th2 型细胞因子相对不足、Th1/Th2 比值变化有一定关系。而Th1/Th2 比值的测定在再障患者的鉴别诊断、病情判断、疗效、预后观察方面具有很高的灵敏度和特异性。Kaitol 等^[13]对用免疫抑制治疗前后再障患者外周血Th1 和Th2 的测定中发现，Th1 及Th1/ Th2 比值在治疗有效的再障患者体内较疗效欠佳者低，而Th2 细胞则变化不大，Th1/Th2 比值在治疗有效的患者中则随造血功能的恢复而逐渐降低，因此他们认为Th1 细胞在再障的病理性免疫机制中可能处于主导作用。

Elena 等^[3]用免疫印记法检测T- bet 蛋白表达水平发现9 例完全缓解的再障患者无T- bet 表达，其余19例经治疗后复发或是部分缓解的患者T- bet 表达水平增高。Dubey 等^[14]分别对正常对照者和再障患者的骨髓及T 淋巴细胞胞浆内TNF- α、IFN- γ 研究发现，再障患者骨髓内TNF- α、IFN- γ 含量明显高于正常对照者，随访中也发现，经ATG 及CsA 治疗前后这些细胞因子在骨髓及T 淋巴细胞胞浆中的浓度有一定的差别；进行180d 的治疗后，这些因子随病情好转而呈下降趋势。因此得出结论，骨髓内启动的T 淋巴细胞分泌的高水平IFN- γ 和TNF- α 等造血负调控因子是导致再障发病的重要机制之一，T- bet 由于强大促IFN- γ 基因转录的活化作用而在Th1 分化中起决定性作用。Th0 细胞产生的IFN - γ 与其受体结合，启动STAT1, 进一步活化T- bet 基因, 而后者启动IFN - γ 基因, 即T- bet 的作用是通过启动IFN- γ 基因而发挥其对Th1 细胞发育的正调控作用。T- bet 的高表达与Th1 型细胞因子的升高相吻合。再障患者T- bet 过量表达是再障时Th1 优势分化的重要原因，说明T- bet 在再障中有重要的作用。