有研究报道,将40只Wistar大鼠随机分成两组,一组用博莱霉素注入大鼠气管内制成肺纤维化大鼠模型,另一组用等积生理盐水注入大鼠气管内作为对照组^{[ 8 ]}。免疫组织化学和逆转录2聚合酶链反应结果表明,博莱霉素致肺纤维化大鼠肺内TGF-β1 蛋白和其mRNA表达均明显增加,它在肺泡巨噬细胞的表达第7天达到高峰,第14、28天持续阳性表达,高于对照组。相关分析表明,肺泡巨噬细胞和肺组织释放的TGF-β1 mRNA呈正相关( r = 0. 78, P < 0. 01) 。由此可以看出,肺组织中TGF-β1 mRNA表达与肺泡巨噬细胞表达趋势一致,呈同步动态变化,说明肺泡巨噬细胞可能是肺内TGF-β1mRNA的主要来源,尤其是在肺纤维化早期的肺泡炎阶段。肺纤维化过程中TGF-β1 mRNA的高度表达,在激发肺泡炎和间质纤维化过程中起重要作用,提示应用基因治疗途径(如反义核糖核酸) ,探求选择性地抑制及调节TGF-β1 mRNA的表达,可能有望在阻止炎性细胞的浸润、活化及影响肺纤维化进程方面获得有意义的结果。

2. 2　CTGF　CTGF属即刻早期基因,编码的蛋白质可诱导成纤维细胞增殖和分泌ECM。生理状态下,机体组织细胞有基础量CTGF分泌;病理状态下, CTGF过度表达与某些增生性或纤维化性疾病的发生密切相关。在CTGF基因启动子序列- 162 bp和- 128 bp之间存在TGF-β的顺式调控元件,故认为CTGF是TGF-β的下游效应介质,这可能是肺纤维化过程中一个关键的调节因子。

有报道,用原位杂交技术和免疫组织化学SABC法分别检测CTGF、TGF-β及3种构成ECM的主要成分纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原在肺内的表达,旨在探讨CTGF的表达与肺纤维化的关系^{[ 9 ]}。结果发现, CTGF mRNA 的表达在肺纤维化中显著增加。证实了CTGF mRNA表达与肺间质纤维化的关系密切。研究同时发现,作为上游因子的TGF-β1在肺纤维化中的表达规律与CTGF几乎完全一致,并与CTGF升高成正比。有文献报道,诱导CTGF表达的主要因子就是TGF-β1 ,当纤维化发生时, CTGF高表达并作为TGF-β下游介质介导ECM的生成。同时,作为构成肺间质ECM 3种主要成分的纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原在肺间质纤维化模型中的表达亦明显高于对照组^{[ 10 ]}。

CTGF作为TGF-β的下游因子,仅介导TGF-β促进肺纤维化的负面效应;其长期过度表达能明显促进纤维化的发生,故CTGF可以作为防治肺纤维化的新靶标。应用CTGF反义技术或特异性抗体阻断TGF-β诱导的成纤维细胞增殖和前胶原物质的产生,对于特发性肺间质纤维化的治疗有可能起到决定性的作用。

2. 3　PDGF　体内外实验证实, PDGF能促进肺成纤维细胞增生和胶原蛋白合成,对调控肺成纤维细胞分裂、增殖及胶原蛋白的合成与降解起十分重要的作用^{[ 11 ]} 。有研究者证实,培养48h后的正常肺泡Ⅱ型细胞,免疫组织化学染色显示细胞内TGF-β1 强阳性, PDGF-B 弱阳性。原位杂交显示细胞内TGF-β1和PDGF-B mRNA均为阴性。而矽肺实验组(矽肺属ILD的一种) 的大多数肺泡Ⅱ型细胞胞质内TGF-β1和PDGF-B的蛋白和mRNA均呈强阳性。原位杂交与免疫组织化学染色双标记发现,光镜下具有Ⅱ型细胞特点、原位杂交有TGF-β1和PDGF-B mRNA阳性信号的细胞,免疫组织化学染色细胞角蛋白抗体、上皮膜抗原均为阳性,白细胞共同抗原为阴性,进一步证实矽肺病变中增生的肺泡Ⅱ型细胞TGF-β1和PDGF-B表达增强^{[ 12 ]}。但总体来讲,在ILD 研究中,单独对PDGF及其基因变化的研究并不多。

2. 4　IFN-γ　IFN-γ主要由Th1淋巴细胞和自然杀伤细胞分泌,它作为一种激活的T细胞产物,在体内外可以抑制成纤维细胞的增殖分裂和胶原蛋白合成,并能调节TGF-β的产生,理论上具有抗纤维化作用。以往认为,应用转基因手段使IFN-γ在体内持续高表达有可能成为肺间质纤维化的有效治疗措施。然而,现有研究表明,在m IFN-γ转基因治疗后,并未见肺纤维化程度减轻,相反有加重的趋势。Chen等^{[ 13 ]}对IFN-γ基因剔除( IFN-γ- / - )小鼠博莱霉素诱导肺损伤模型的研究显示,肺损伤模型的肺实质炎症、病死率、体质量减低和肺组织羟脯氨酸含量明显低于IFN-γ+ / + 的野生型对照组。而后者给予博莱霉素第3天和第6天时,肺组织中T淋巴细胞产生IFN-γ的量较正常肺组织T淋巴细胞产生IFN-γ的量高达20倍。此外,在给予博莱霉素24 h前,气管内预防性使用重组IFN-γ可明显加强肺的炎性反应。其发生机制可能与IFN-γ诱导其他炎性因子的产生有关,如IFN-γ可上调炎性因子( 如肿瘤坏死因子α)的表达和活性,并与之有协同作用,加重肺内炎性反应和肺损伤的程度。田桂珍等^{[ 14 ]}研究,在博莱霉素诱导的肺损伤早期(给药后第3天)给予重组腺病毒IFN-γ, IFN-γ在肺内局部高表达,其结果也使炎性反应和纤维化程度加重。说明, IFN-γ在肺损伤早期高表达有可能增强博莱霉素所致的肺损伤,这与Chen等^{[ 13 ]}的研究结果十分相似,由此推测, IFN-γ对博莱霉素致小鼠肺纤维化的作用可能呈时间2剂量相关性。换言之,在小鼠纤维化模型中,利用重组腺病毒IFN-γ进行IFN-γ转基因治疗的过程中,应进一步探讨给予重组腺病毒IFN-γ的最佳时间和剂量切入点。