[摘　要] 目的:探讨中国HIV21B’/ C 亚型感染者对自身病毒中和作用与疾病进展的关系。方法:将24 例HIV-1 B’/ C感染者自身原代病毒与同期和6 个月自身血浆作用后,感染正常PBMC ,培养7 天测定p24 抗原浓度,以正常人血浆加病毒悬液为对照。以抑制50 %对照孔p24 浓度的血浆最高稀释倍数的倒数计算中和抗体滴度,中和抗体滴度≥8 倍为具有中和作用。结果:在同期血浆中和自身病毒试验中,3 例缓慢进展者(SP) 均具有中和作用,HIV 组仅4 例(4/ 21) 具有中和作用,SP 组中和抗体滴度明显高于HIV 组。在6 个月血浆中和自身病毒试验中,SP 组中和抗体滴度明显增加,HIV 组12 例具有中和作用,SP 组中和抗体滴度明显高于HIV 组。中和抗体滴度与病毒载量呈明显的负相关。结论:疾病缓慢进展的HIV-1B’/ C 亚型感染者对自身病毒中和作用明显高于HIV 组,提示中和抗体在延缓疾病进程中发挥重要作用。

HIV-1 感染机体后可以诱导产生体液免疫和细胞免疫^{[1 ]} 。已有研究表明,利用HIV-1 单克隆抗体(MAbs) 被动免疫短尾猴后可以保护短尾猴免受病原性SHIV 的攻击,提示中和抗体在HIV-1 感染的过程中可能具有保护作用。国外学者对B 亚型HIV-1感染者研究显示,缓慢进展者与典型进展者和快速进展者相比,体内含有较高水平具有广泛中和作用的中和抗体,且中和抗体水平随着时间的增加而增加^{[2 ,3 ]} 。但Barker 等^{[4 ]} 研究表明,虽然缓慢进展者和典型进展者都可以检测到针对自身病毒的中和抗体,但中和抗体水平在两组之间没有显著性差异,疾病进展与对自身病毒的中和作用无关。HIV-1 不同亚型之间中和抗体的保护作用也不尽相同,与B 亚型HIV-1 感染者相比,来自非洲地区的C 亚型HIV-1感染者血浆可以中和原代病毒,具有较高的中和作用^{[5 ]} 。可见中和抗体对HIV-1 感染者的保护作用以及与疾病进展的关系还有待明确。

HIV-1 B’/ C 亚型是中国主要流行株, 占中国HIV-1 总感染人数的47 %。目前尚无对中国B’/ C亚型HIV-1 感染者采用不同时期自身血浆对自身病毒中和作用方面的报道。本研究采用PBMC中和抗体实验^{[6 ]} ,通过测定中国B’/ C 亚型HIV-1 感染者不同时期自身血浆对自身病毒的中和抗体水平,研究中国B’/ C 亚型HIV-1 感染者中和抗体水平的变化特点以及中和抗体水平与疾病进展的关系,为HIV疫苗研究提供科学依据。

1 　材料与方法

1、1 　实验对象　24 名研究对象来源于本室艾滋病自然史队列,其HIV-1 感染由中国医科大学附属一院艾滋病确认实验室根据《中华人民共和国HIV/AIDS 诊断标准》用WB 试验确认为阳性,均未经抗病毒治疗。24 例HIV-1 感染者中,缓慢进展者组(SP) 3 例(感染时间> 10 年,CD4 + T 淋巴细胞> 500个/μl ,无艾滋病指征性症状) ,HIV 组21 例(感染时间> 5 年,CD4 + T 淋巴细胞介于200～500 个/μl ,无艾滋病指征性症状) 。每名患者采集双份全血,间隔6 个月后,离心分离血浆和PBMC。血浆- 80 ℃冻存,新鲜的PBMC 用于病毒分离。采集正常人EDTA抗凝静脉血离心分离血浆和PBMC ,血浆- 80 ℃冻存,PBMC 用于中和抗体实验。所有研究对象均填写知情同意书。

1. 2 　CD4 绝对值计数　将20 μl CD4/ CD8/ CD3TriTEST试剂加入CD4 绝对计数管中,加入50μl 抗凝血,室温避光15 分钟,加入免洗溶血素450μl ,室温避光15 分钟,FACS MULTISET软件检测并进行自动分析,计算CD4 + 、CD8 + 、CD3 + T 淋巴细胞绝对值及相应比值等。

1. 3 　病毒载量测定　分离病毒的同时进行病毒载量的测定。采用RT-PCR 方法,按照罗氏公司HIV病毒载量测定说明书进行操作。病毒载量的最低检出线为400 copies/ ml 。HIV-1 感染者的病毒载量转化为以10 为底的对数用于统计学分析。

1. 4 　病毒分离　采用PBMC 共培养法分离病毒^{[7 ]} 。用密度梯度离心法分离患者和健康人PBMC。将正常人PBMC 用含2. 0 μg / ml 植物血凝素( PHA) 的RPMI1640 (美国Gibco 公司) 预刺激培养72 小时。在病毒分离24 小时前,将PBMC 用20 U/ ml IL-2 (美国罗氏公司) 活化,于24 孔板中备板。每孔加1 ml含PBMC(浓度为1 ×106 cells/ ml) 的1640 (含10 %胎牛血清,1 % L-2谷氨酰胺,2μg / ml 聚凝胺,1 %青2链霉素和20 U/ ml 的IL-2) 。加入等量浓度的患者PBMC 37 ℃、5 %CO2 共同培养。每3 天换液,每7 天加入新鲜预刺激72 小时的健康人PBMC。1 周后,每3 天测一次p24 ,直至30 天。p24 阳性的上清收集冻存于- 80 ℃冰箱中备用。

病毒库的准备: 扩增的病毒采用感染正常人PBMC方法^{[8 ]} 。将1ml原代病毒加到1ml含10×106CD8剔除的PHA 预刺激的健康人PBMC 的RPMI1640 中,37 ℃培养1 小时。然后将细胞用10 ml 含20 U/ ml IL-2 的RPMI1640重悬,37 ℃培养16～18 小时。第二天,用RPMI1640 洗细胞后重悬,培养5～10 天测p24。p24 阳性的上清收集冻存于- 80 ℃冰箱中备用。