1. 5 TCID50 检测 将PHA 预刺激的健康人PBMC经20 U/ ml IL-2 活化后,调整浓度为4 ×105 cells /ml 。96 孔板中每孔加入PBMC 悬液50μl 。每孔加入经4 倍稀释至428 的病毒悬液50μl 、37 ℃、5 %CO2培养。第3 天换液,第7 天测p24。以Spearman2Karber 方法计算TCID50。
1. 6 亚型测定 全血提取核酸,采用PCR 对gag、pol 区基因片段进行扩增。反应产物经提纯后,在美国ABI 公司的377 型DNA 全自动测序仪上进行序列测定和分析。测得的序列用Bioedit 软件进行编辑校正后,使用Wisconsin PackageGCG (Version 10)软件进行分析。以Pileup 程序对样品及国际标准序列进行排列和比较,其中,国际标准参考序列从美国Los Alamos 核酸序列库网站下载, 用Meg 软件的Neighbor2joining 法绘制系统进化树。
1. 7 中和抗体实验[6 ] 56 ℃,30 分钟灭活HIV-1 感染者和正常人血浆(NHP) 。用正常人血浆对HIV-1感染者血浆进行倍比稀释:2 倍稀释5 次(从1/ 8～1/ 128) ,每个稀释度的血浆量是25μL 。把稀释后的血浆加入96 孔板(3 个平行孔) 。在每孔中加入25μl 含100 TCID50 病毒稀释液,把培养板放入37 ℃孵箱孵育30 分钟。加入50μl 用1640 培养液(含10 %FBS、2 %PS、1 %L2glulamin) 悬浮的PHA 预刺激3 天健康人PBMC ,按每孔5 ×105 cells 加入培养板中,培养16～18 小时,洗涤细胞3 次,用200μl 培养液重悬细胞,培养第4 天换液,第7 天测p24。以正常人血浆加病毒悬液为对照孔。以抑制50 %阴性孔p24浓度的血浆稀释倍数的倒数计算中和抗体滴度。中和抗体滴度≥1∶8 为具有中和作用,表现为中和敏感表型,中和抗体滴度< 1∶8 无中和作用,表现为中和耐受表型。
1. 8 统计学分析 所有统计均采用SPSS15. 0 软件非参数检验。不同时期血浆对自身病毒中和抗体水平的比较采用Wilcoxon 检验;不同疾病进展阶段患者之间中和抗体水平的差异用Mann-Whitney U 检验;中和抗体与病毒载量的相关性分析采用Spearman 检验。不同疾病进展阶段中和抗体发挥作用数量的比较采用χ2 检验。
2 结果
2. 1 研究对象的总体特征 24 株原代病毒全部来源于男性HIV-1 感染者,平均年龄38. 8 岁。23 例经吸毒途径感染,1 例经性途径感染,平均CD4 + T 淋巴细胞为(353. 29 ±103. 29) 个/μl ;平均病毒载量为(89 370 ±130 339. 1) 拷贝/ ml 。病毒分离株经系统进化树分析均为B’/ C 重组亚型(见表1) 。
2. 2 不同时期血浆对自身病毒的中和作用 我们将从血液标本中分离到的病毒设为V ,同时期的血浆标本设为P0 ;6 个月后血浆设为P6 。在P0-V 的中和抗体实验中,7 例可以中和自身病毒,17 例对自身病毒无中和作用。在P6-V 的中和抗体试验中,14例可以中和自身病毒。同期血浆和6 个月后血浆对自体病毒中和抗体滴度存在显著性差异( P =0.001) 。P6-V 的中和抗体试验中病毒被中和的数量(14/ 24) 明显高于P0-V 病毒被中和的数量(7/ 24)( P = 0. 04) ,见表1。
2. 3 不同时期血浆对自身病毒的中和作用与疾病进展的关系 在P0-V 中和抗体试验中,SP 组均具有中和抗体作用,而HIV 组仅有4 例具有中和作用,其余17 例无中和作用,SP 组中和抗体滴度显著高于HIV 组( P = 0. 007) 。在P6-V 中和抗体试验中,HIV 组有12 例具有中和作用,9 例无中和作用,SP组中和抗体水平明显增加,SP 组中和抗体滴度显著高于HIV 组( P = 0. 016) ,见图1。
