4 　HIV-1 的定量分子诊断

HIV-1 的定量分子诊断即病毒载量测定。常用的HIV 病毒载量测定方法有逆转录PCR 扩增(RT-PCR) 、分支DNA 杂交扩增( bDNA) 、核酸序列扩增(NASBA) 。3 种方法的比较见表1 。

表1 　3 类已获FDA 批准的病毒载量检测方法的比较

HIV 病毒载量测定具有以下功能: ①辅助诊断:当RNA 测定出现较高拷贝数的阳性结果时( > 3 000 拷贝/ mL) ,已感染的可能性极大。②早期诊断:感染早期,抗原峰前后通常出现一个病毒载量高峰,此高峰通常高于发病时的血浆病毒水平,该时期具有很高的感染能力,因此早期病毒测定具有特殊意义。该方法也可用于HIV 感染孕妇所生婴儿的早期辅助诊断。③病程监控。④疗效判定:通常认为4 周治疗后载量降低0.51 g 以上,或治疗8 周载量降低1.01 g 以上,或治疗16～24周载量< 1 000 拷贝/ mL ,视为临床有效。⑤预测病程:HIV 感染后疾病进程与病毒载量的关系十分密切,测定病毒RNA 水平可大致预测其发病的可能。⑥血库血源的安全监控:采用核酸池技术,对多份血样同时检测。

4.1 　RT-PCR 技术:通过逆转录酶使病毒RNA 逆转录为cDNA ,随后进行多聚酶链式反应,指数扩增DNA 片段,如表1 所示Amplicor 试剂盒通过将放大产物变性,然后与多孔板结合,利用酶联系统进行检测,但该方法整个检测过程约需时1 d。由于RT-PCR 技术可在2 h 内使扩增产物达到凝胶电泳或实时荧光法可检测的水平,多种改良的快速RT-PCR 检测方法可实现HIV 的快速临床诊断^{[5 ,6 ]} 。

4. 2 　bDNA 检则法: 目前市场已开发的产品为bDNA 定量检测血浆中HIV-1 型RNA。该方法通过将捕捉到的病毒基因信号进行扩增直接检测RNA ,即从HIV 中提取分离RNA ,与靶探针杂交抽取RNA ,再通过另一部分靶探针使支链DNA 分子与RNA 结合,利用化学发光原理进行扩增信号,发光强度与HIV2RNA 含量呈比例关系^{[7 ]} 。bDNA 可测出单个拷贝的HIV ,实际灵敏度可测出约每毫升10 000 个HIV ,其改良方法可达每毫升约500 个HIV。耗时较长,约20 h 且需过夜,因bDNA 为信号扩增系统无扩增物的交叉污染,这是与PCR 的主要区别。它可检出所有亚型,但敏感度稍低。就bDNA 技术而言,使用的探针越多和核酸杂交步骤越多,其敏感性将越高。但由此所带来的非特异性结合也会随之增加。有报道表明,通过引入非天然的碱基如异胞嘧啶和异鸟嘌呤,可明显减少杂交过程所致的背景噪音。这一技术是提高分支DNA 方法的有益尝试,可广泛应用于基于分支DNA 的HIV 及其他病毒的定量分析。