4. 3 　核酸序列介导的转录性扩增:核酸序列的转录性扩增与常规PCR 不同,其起始模板和最终产物均为RNA 而不是DNA。相应方法据其所用的酶而分为NASBA 或转录介导的扩增( TMA) 。核酸序列扩增使用AMV 逆转录酶、RNA 酶H 和T7RNA 聚合酶; 转录介导的扩增则仅使用MLV 逆转录酶和T7 RNA 聚合酶,因MLV 逆转录酶含有RNA 酶H 活性。反应过程包括了4 个连续且不断循环的步骤: ①上述酶类通过与一对序列特异性引物结合,完成cDNA 反义链的合成。②cDNA 反义链与RNA 杂合核酸分子中RNA 的降解。③cDNA 有义链的合成。④通过人工引物所含有的RNA 聚合酶启动子序列所介导的转录反应而生成RNA 新生链。上述反应中1 个RNA 分子在1 次循环中只能生成1 个cDNA 分子,而1 个cDNA 分子可转录生成100～1 000 个RNA 分子,因而上述反应的不断循环进行,可在常温下(如42 ℃) 约90min 内使模板分子扩增至109 倍。核酸序列介导的转录性扩增,因不需要高温循环过程,可适用于野外现场和实验室不同条件。因其高效扩增特性,既可与多孔板酶介导的显像技术,也可与荧光实时检测结合。对传染病病原的定性与定量检测而言,这类方法因扩增产物的不稳定性特征,减少了分子诊断实验室扩增产物的交叉污染。目前,核酸序列介导的转录性扩增技术已用于HIV-1 的分子诊断^{[8 ,9 ]} 。

5 　可用于开发HIV诊断试剂的分子诊断新技术

5. 1 　PCR 扩增产物的荧光检测技术

具有荧光发射能力的物质间可通过多种相互作用而用于生物大分子的检测,包括偏振、淬灭、时间关联、荧光寿命改变、荧光强度改变以及荧光共振能量转移。在PCR 扩增产物的实时检测方面,目前主要有以下4 种应用: 非特异荧光染料如SYBR Green、序列特异性的Taqman 探针、序列特异性的分子信标和序列特异性的荧光共振能量转移探针对。这些荧光实时PCR 检测技术的应用,使HIV 病毒定性与定量检测方法在原有基础上产生了质的飞跃,避免了传统的电泳终点检测,不但可以进行定性检测还可进行定量检测,更使整个反应与检测全过程在同一封闭体系内完成,大大降低了实验室感染和污染的机会。美国PE 公司开发的Taqman 技术,已广泛应用于基因检测。我国在2002 年4 月由国家食品药品监督管理局( SFDA)批准了第一个HIV 荧光PCR 检测试剂盒。

5. 2 　高特异性的突变检测新技术

5. 2. 1 　焦磷酸水解激活的DNA 聚合反应(pyrophosphorolysis2activated polymerization , PAP) 技
术:PAP 由美国NIH 国家肿瘤中心Dr. Sommer 实验室开发的^{[10-12 ]} ,该PAP 技术利用Taq 聚合酶的
焦磷酸水解反应激活惰性引物,然后偶联DNA 聚合反应,使待测分子呈指数扩增。该方法较大多现有的突变检测方法敏感,能检测的单分子的突变,且适宜于多重PCR。但其所需无活性引物昂贵,对单一拷贝的DNA 分子常需40～50 个PCR 循环。另外,该方法对突变识别存在序列歧视现象,即某些特定序列不能焦磷酸酶水解因而难以结合惰性引物,故无或甚少发生与之偶联的DNA 聚合反应。目前仅用于体细胞突变的检测,其相对较高的敏感性和特异性,可应用于一些特定HIV 已知突变的检测。

5. 2. 2 　高保真聚合酶介导的突变敏感性分子开关:突变敏感性分子开关的工作原理是利用高保真聚合酶与耐外切酶消化的硫化磷酸修饰的碱基特异性引物联合时,对基因突变序列或多态性具有高度辨认能力^{[13-15 ]} 。对硫化磷酸修饰的碱基特异性引物而言,高保真聚合酶分子中相距3 nm 的聚合中心和3′→5′外切酶酶解中心则既合作又独立地起到了复合分子开关中“开”和“关”的效能:对于配对的引物,则直接在该酶的聚合中心进行DNA 聚合反应;而对于3′末端错配的引物,则从该酶的聚合中心转移至3′→5′外切酶的酶解中心,由于其修饰了的3′末端耐外切酶的特点,继而出现了一种长时间无酶解产物的酶解过程,最后因酶的聚合中心空转而“关闭”DNA 聚合反应。这种配对引物被延伸,而不配对引物则不被延伸的二元化效果,完美地满足了SNP 分析时需要对特定位点进行非此即彼的二元化辨认。

在信号的分析方面,这一新分子“开关”可通过与SYBR Green 等非特异性信号分子组合,也可与作为探针的分子信标或特定引物5′的分子信标组合,进行扩增产物的实时检测; 此外,还可直接通过凝胶电泳检测引物延伸产物的有无,与现有的突变检测方法相比,由高保真聚合酶所介导的复合分子“开关”,除其特有的高可靠性之外,还具有经济、实用和可应用于高通量分析的多种方法测定突变等优点。因此该方法可以提供一种更高特异性、高灵敏性、快速的HIV 病毒检测方法,可对病毒的携带情况作出早期判断,而且可通过病毒载量分析用于临床治疗效果观察。