2. 2 化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析(Chemiluminescent enzyme immunoassay ,CLEIA) 属酶免疫分析,只是酶反应的底
物是发光剂,操作步骤与酶免分析完全相同:以酶标记生物活性物质进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(ALP) ,它们有各自的发光底物。
HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中,使用过氧化物酶标记抗体,进行免疫反应后,利用鲁米诺作为发光底物,在过氧化物酶和起动发光试剂(NaOH 和H2O2) 作用下鲁米诺发光,酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。此传统的化学发光体系(HRP-H2O2-luminol) 为几秒内瞬时闪光,存在发光强度低、不易测量等缺点[6 ] 。后来,在发光系统中加入增强发光剂,以增强发光信号, 并在较长的时间内保持稳定, 便于重复测量,从而提高分析灵敏度和准确性。
碱性磷酸酶(ALP) 已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。碱性磷酸酶和1 ,2-二氧环乙烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的一类化学发光体系。这类体系中具有代表性的是Bronstein 等[7 ]提出的ALP-AMPPD 发光体系。在溶液中AMPPD 的磷酸酯键很稳定,非酶催化的水解非常慢,在pH12 的0. 05 mol/ L 碳酸钠缓冲溶液中,分解半衰期可达74年,几乎没有试剂本身的发光背景。AMPPD 为磷酸酯酶的直接发光底物,可用来检测碱性磷酸酶或抗体、核酸探针及其他配基的结合物。ALP-AMPPD 发体系具有非常高的灵敏度,对标记物ALP 的检测限达10 - 21 mol ,是最灵敏的免疫测定方法之一。对AMPPD 加以改进,获得具有更好反应动力学和更高灵敏度的新一代产物:CSPD、CDP2Star。这些体系已广泛用于各种基因、病原体DNA 的鉴定。
2. 3 电化学发光免疫分析
电化学发光免疫分析( Electrochemiluminescence ,ECL) 是指由电化学反应引起的化学发光过程。ECL的反应在电极表面进行,发光底物为三联吡啶钌[Ru (byp) 2 +3 ] ,三丙胺(TPA) 用来激发光反应。在阳极表面,两种物质同时失去电子。在电极板上Ru(byp) 2 +3 被氧化成Ru (byp) 3 +3 ,TPA 也被氧化成阳离子自由基(TPA+3 ) ,TPA+ 3自发地释放一个质子而变成非稳定分子( TPA3 ) , 将一个电子递给Ru(byp) 3 +3 ,形成激发态的Ru (byp) 2 + 33 。Ru (byp) 2 + 33在衰减的同时发射一个波长为620 nm 的光子,重新回到基态Ru (byp) 2 +3 。这一过程在电极表面反复进行,产生高效、稳定的连续发光,并不断增强[8 ] 。
ECL 的突出优点是: ①标记分子小,可实现多标记,标记物非常稳定; ②发光时间长,灵敏度高; ③光信号线性好,动力学范围宽,超过6 个数量级; ④可重复测量,重现性好; ⑤可实现多元检测和均相免疫分析; ⑥快速,完成一个样品的分析通常只需18 min ;⑦可实现全自动化。由于电化学发光免疫分析具有优越性,是一种很有发展前途的免疫分析法,日益受到人们的重视,目前已广泛应用于抗原、半抗原及抗体的免疫检测。
3. 化学发光免疫分析技术的应用
CLIA 不需要外来光源,具有比IFA 更高的信噪比,最低可以检测到100 个分子,其灵敏度比RIA 或EIA 高1 至2 个数量级,检测范围可达6 个数量级,自动化程度高,提高了分析方法的精密度。CLIA 已经成为一种先进的痕量或超痕量物质的检测技术。
3. 1 在兽医学上的应用:CLIA 在兽医检测诊断研究和应用还处在初期阶段,国内外的文献报道很少。主要因为CLIA 是一项涉及化学、生物和兽医等交叉学科的复杂性的技术,因此,制约了CLIA 在兽医检测诊断中的研究和应用。
