[摘要] 基因递送是生物学和医学研究中一项重要且常用的技术,分为病毒感染法和非病毒转染法两大类。病毒载体具有较高转染效率,但产生不良反应等缺陷限制了其应用。非病毒载体具有低细胞毒性、低免疫原性、生物相容性好、可以生物降解等优点,而且不受基因大小的限制,具有很好的应用前景,但转染效率不高是其主要的瓶颈,目前研究人员正致力于寻找和开发高效率的非病毒转染方法。文中阐述了几种主要的生化转染法(阳离子多聚物、阳离子脂质体、磷酸钙)及物理转染法(电穿孔、超声/微气泡、显微注射和基因枪)的原理、优缺点以及研究进展。
基因递送技术目前已成为生物学和医学研究中一项重要且常用的技术,运用该技术可以进行外源基因的高效表达、蛋白结构与功能的研究以及生产目的蛋白;基因表达调控机制的研究,实现细胞的表型改变或转化;基因治疗与转基因动物的研究; RNA干扰以及核酸类药物的研究等。
将外源基因或寡核苷酸导入真核细胞的方法有很多种,大体可分为2大类:病毒感染法和非病毒转染法。作为目前基因治疗的主要工具,病毒载体具有很高的转染效率,但其携带基因长度有限、可能引起免疫反应与细胞毒性、具有潜在致癌性、应用细胞类型有限、成本较高等缺点限制了其广泛应用。因此,人们将注意力更多地投向了非病毒转染法。非病毒载体具有低细胞毒性和低免疫原性、生物相容性好、可以生物降解等优点,而且不受基因大小的限制,具有很好的应用前景。目前,非病毒转染法主要包括物理转染法和生化转染法,是研究的热点,部分方法已经应用于体外和体内实验,但转染效率不高是其最主要的瓶颈,目前研究人员正致力于寻找和开发高效率的非病毒转染方法。现就非病毒转染法的原理和优缺点,以及最新研究进展做一综述。
生化转染法
生化转染法是应用阳离子多聚物(如聚赖氨酸) 、两亲性化合物(如脂质体)以及非有机化合物(如磷酸钙)凝聚带负电荷的核酸形成复合物,结合到细胞膜表面,通过内吞或膜融合作用进入胞内。生化法转染效率受限的原因主要有:从内吞泡释放的核酸量少;核酸缺乏保护而被内源性核酸酶降解;进入细胞核的核酸量少。此外,有效的转染往往伴随某些毒性或细胞抑制,程度随试剂、操作和目的细胞而变。因此人们寻找新的非病毒转染载体的同时,也在对已有载体和方法进行优化以达到最佳效果。
阳离子多聚物
阳离子多聚物转染的共同原理可能是:生理pH条件下把DNA凝聚形成复合物,附着在细胞膜上被内吞进入胞内, 复合物的形成可以防止DNA 被DNase降解。阳离子多聚物和阳离子脂质最大的区别在于其不含疏水部分而完全溶于水,并可以方便地进行化学修饰,如改变相对分子质量、构象(线状或分枝状)及偶联配体等。
1. 1. 1 二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)和聚凝胺( Polybrene) 1965年Pagano和Vaheri首先利用
DEAE-dextran将脊髓灰质炎病毒RNA 导入细胞。1968年人们又用DEAE-dextran 将SV40 与多瘤病毒DNA导入细胞。1984年Kawai等在促进剂二甲基亚砜(DMSO) 存在的情况下,用聚阳离子Polybrene ( 1, 5-dimethyl-1, 5-diazaundecamethylene poly methobromide) 转染对其他方法不敏感的细胞系。
DEAE-dextran用于转染的机制不甚明了,可能是由带正电的DEAE-dextran和带负电的DNA分子形成复合体,结合在细胞膜表面,内吞进入胞浆内吞小体,随后DNA通过某种未知机制脱离内吞小体,穿越质膜进入核内。
DEAE-dextran仅用于瞬时转染,除了作为转染试剂,还可以用作提高电穿孔转染效率的佐剂。它对BSC-1, CV-1, COS等细胞系非常有效,但对其他类型的细胞转染效果不太理想,转染所用DNA的量较磷酸钙方法少,实验重复性较好。Polybrene除单用于转染外,还可提高脂染的效率。
影响DEAE-dextran转染效率的因素包括:细胞密度与生长状态;所用DNA的量和作用时间; DE-AE-dextran的相对分子质量与浓度;促进剂(如DMSO、氯喹或甘油)的浓度和作用时间;细胞生长状态(贴壁或悬浮) 。影响Polybrene转染效率的因素有DMSO浓度、聚阳离子浓度、DNA量、转染温度和时间等。
Onishi等[ 1 ]研究发现一种分枝状共聚物diethylaminoethyl-dextran-methyl methacrylate (DEAE-dex-tran-MMA)可以形成稳定无泡乳液,高压灭菌不会破坏其结构,可以高度保护DNA不被DNase降解,并高效转染。Jacobsen 等[ 2 ] 研究发现用Polybrene包裹重组腺病毒,在体外和体内实验中均可提高转染效率。
