1. 1. 2 多聚-L -赖氨酸( PLL) 1987年,Wu等[ 3 ]用脱唾液酸血清类黏蛋白( asialoorosomucoid, ASOR)与PLL偶联,成功将质粒导入表面有脱唾液酸蛋白受体的肝细胞并表达。PLL是赖氨酸重复单元组成的线性多肽,其可生物降解的特点适于体内应用。然而, PLL进入循环系统后迅速和血浆蛋白结合并清除,降低了转染效率。此外,促进剂氯喹的使用增加了毒性[ 4 ] 。
人们测试了许多不同相对分子质量PLL的转染效率,发现相对分子质量越大,凝聚DNA的能力越强,转染效率越高, 但同时毒性也越大。Brown等[ 5 ]研究发现将PLL 共价连上软酯酰基团和甲氧基聚乙二醇(mPEG) ,增强其两亲性,在降低毒性的同时转染效率没有降低。Okuda等[ 6 ]研究发现第6代树枝状PLL (KG6)有很高的转染效率,而无明显毒性和细胞特异性。
1. 1. 3 壳聚糖 壳聚糖是一种聚多糖,目前还不清楚壳聚糖转染的确切机制,可能的解释是:带正电荷的壳聚糖与带负电荷的DNA凝聚形成复合物,被内吞进细胞内,复合物的形成保护了DNA不被降解。壳聚糖是一种生物大分子,生物相容性好,对细胞无毒,免疫原性低,可用于体内实验,成本较低。壳聚糖转染效率较脂质体低,转染效率受缓冲液pH值、血清浓度以及壳聚糖相对分子质量等的影响。
将壳聚糖进行化学修饰,从而改变其理化性质,可以提高转染效率。Kim等[ 7 ]研究发现用脱氧胆酸对壳聚糖进行疏水性修饰,可以提高对COS-1细胞的转染效率。Yoo等[ 8 ]研究发现用乙二醇修饰壳聚糖,在体内、体外实验中均提高了转染效率。为使DNA进入特定的靶细胞,可以将壳聚糖与不同的配体偶联。Gao等[ 9 ]研究发现半乳糖修饰的低相对分子质量壳聚糖可以通过受体介导的内吞作用高效转染HepG2 细胞, 而毒性较Lipofectamine 和磷酸钙小。Kim等[ 10 ]制备了半乳糖修饰的壳聚糖,实验证明这一体系能高效转染表达有脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)的HepG2 细胞,并且未显示细胞毒性。此外, Zuo 等[ 11 ] 研究发现通过共转染壳聚糖酶基因,促进入胞的壳聚糖/DNA复合体解聚,可以提高转染效率。
1. 1. 4 聚乙烯亚胺( PEI) PEI可作为基因递送载体。PE I单体( -CH-CH2-NH2-)中每3个原子含1个氨基,富含阳离子,容易结合DNA 以及附着细胞。PEI转染的可能机制与其他阳离子多聚物类似,入胞后PEI的“质子海绵样作用”可使内吞泡崩解,复合物释放入胞质,接着进入核内转录、表达[ 12 ] 。
PEI有2种结构形式:线状分子和分枝状分子,用作基因递送载体具有简便、经济、转染效率高的优点,可用于体外和体内实验。PE I的毒性主要来自游离PEI,和DNA结合后毒性降低[ 13 ] ,低浓度时可能不会伤害细胞膜[ 14 ] 。
影响PEI转染效率的因素包括: PE I的相对分子质量及分枝程度; PEI/DNA 复合物的形状和大小; N /P值( PE I的氨基: DNA的磷酸基) ;缓冲液离子强度;混合的速度和DNA浓度; PEI或DNA偶联的配体等。
将PEI和特定配体偶联可以提高转染效率,增强靶向性,降低毒性。已报道的和PE I偶联的配体包括:半乳糖、甘露糖、叶酸、上皮细胞生长因子、转铁蛋白等。Kircheis等[ 15 ]将PEG化的PE I和肿瘤特异性配体转铁蛋白偶联,转染效率增加了5倍,而毒性降低。为综合阳离子聚合物和脂质的优点,Han等[ 16 ]合成了一种PE I2胆固醇化合物,它溶于水且对多种细胞无毒性。Kim等[ 17 ]设计了一系列用酸不稳定亚胺连接的PE I,在酸性内吞泡中迅速降解,毒性比相对分子质量25 000的PEI明显降低。
阳离子脂质体
自1987年Felgner发现阳离子脂类与DNA自动形成可与细胞膜融合的单层外壳,并运用N -[ 1-(2, 3-二油基氧)丙基] -N, N, N -氯化三甲铵(DOTMA,商品名: lipofectin)以来,阳离子型脂质体介导的转染方法得到越来越广泛的应用。陆续发现了多种阳离子脂类可以形成阳离子型脂质体,其中有些已经商品化,如: Life Technologies L ipofectinTM , LipofectAM INETM , Promega TransfectamTM , Invitrogen InsectinTM等。
阳离子脂质体除了含阳离子脂类外,还有中性辅助脂类,如:二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE) 、1, 2-二油酸甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC) 、胆固醇。阳离子脂类可以和辅助脂类形成脂质体,也可以在生理pH值下和带负电荷的DNA直接结合形成复合体,通过膜融合或非特异的内吞作用进入细胞。实验证明阳离子脂类与等摩尔中性脂形成的共脂质可提高转染效率,原因是降低了脂质/DNA 复合体对DNAseI的敏感性[ 18 ] 。
