阳离子脂质体是人工合成的,无抗原性,可生物降解,用作核酸递送操作简单,重复性好,适用的细胞类型广,相对于传统的磷酸钙沉淀法转染效率高。阳离子脂质体的主要缺点是对细胞的毒性,主要表现为细胞聚集,贴壁性差。另外,转染的效率易受血清中的脂肪与脂蛋白以及细胞外基质中的带电成分,如硫酸软骨素等的干扰。

为达到最高转染效率,需要优化的条件主要是:转染细胞的密度;核酸纯度;脂质体的浓度、核酸的浓度以及脂质体/核酸复合物和细胞的孵育时间;培养细胞所用的培养基与血清等。

Nakanishi等^{[ 19 ]}在脂质体基础上引入能与细胞膜融合的病毒仙台病毒形成杂合体,即膜融合脂质体( fusogenic liposome, FL) ,大大减少了由于内吞作用而被溶酶体降解的几率,提高了转染效率,同时也降低了细胞毒性。Tokunaga等^{[ 20 ]}研究发现寡多肽和DNA、脂质体形成的三元复合体有高效低毒的特点,更好地保护了DNA不被DNAse I降解,并减少了与血浆蛋白的结合。Maeda等^{[ 21 ]}研究发现用精氨酸8肽(R8)和聚乙二醇( PEG)修饰,得到新型载体PEG-S-S-DOPE-脂质体,在向A431细胞转染质粒的实验中,可得到接近100%的转染率。

磷酸钙

DNA可以和磷酸钙形成共沉淀附着于细胞表面,通过内吞作用进入多种培养的哺乳动物细胞。1973年Graham和van der EB首次报道了用磷酸钙沉淀法将腺病毒和SV40 病毒DNA 导入哺乳动物细胞。几年以后,W igler等证明这种方法也能用于导入并在哺乳动物染色体上稳定整合的外源DNA。此后,人们又发现通过增加诸如甘油休克和/或氯喹处理等辅助步骤可以提高转染效率。

磷酸钙试剂实验室即可配制,无毒性,可生物降解,用于转染具有方法简单、成本低廉的优点。缺点是相对于病毒载体, 转染效率非常低( 10% ～15% ) ;难以用于体内转染研究;由于每次形成的磷酸钙/DNA沉淀大小不同,实验重复性差; 需要的DNA量较大。此外,用磷酸钙或DEAE2dextran转染哺乳动物细胞时,可引起转染片段突变(每个基因突变率约1% ) 。

磷酸钙转染效率受到诸多因素的影响,例如:沉淀颗粒的形态、大小和质量; 沉淀和细胞孵育的时间;钙离子浓度、DNA浓度、缓冲液pH以及细胞类型等。磷酸钙转染效率低的主要原因是形成的微粒体积太大(直径平均值大于300 nm) ,磷酸钙/DNA复合物穿过细胞膜的速度太慢^{[ 22 ]} 。Bisht等^{[ 23 ]}成功制备了病毒大小的磷酸钙微粒(直径在100 nm以下) ,和质粒形成复合物后起到了保护作用,并且在温和的酸性环境下更易于溶解,提高了转染效率,达到和商品化的转染试剂Polyfect相同的水平。

物理转染法

电穿孔

1982年Neumann首先报道用电脉冲将DNA导入活细胞。当细胞被置于非常高的脉冲电场中,细胞膜就能可逆地形成瞬时的水通道或小孔,使外部分子得以进入细胞内,这一现象被称为电穿孔。运用这一技术,许多物质包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针等都能导入细胞,临床上已有报道用该方法协助博来霉素导入肿瘤细胞^{[ 24 ]} 。

电穿孔技术适用的细胞类型广泛,包括细菌、酵母、植物和动物细胞。而且它还能作为注射方法(称为电注射) ,把各种外源物质引入活细胞。与其他常用的导入外源物质的方法相比,电穿孔具有很多优点: ①不必像显微注射那样使用玻璃针,不需要技术培训和昂贵的设备,可以一次对成百万的细胞进行注射。②与用化学物质或病毒法进行转导相比,电穿孔几乎没有生物或化学副作用。③因为电穿孔是一个物理方法,较少依赖细胞类型,因而应用广泛,对大多数细胞类型,用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多。

应用电穿孔技术需要购买昂贵的设备,一般情况下,高电场强度会杀死50% ～70%的细胞,因此特别注意要优化外加电场的强度和电脉冲的长度,其他需优化的条件还包括温度、DNA 的构象与浓度、细胞状态以及培养基的成分等。
电穿孔技术用于基因治疗已进入临床前动物实验阶段,主要用于免疫治疗、癌症治疗、代谢紊乱治疗和器官或特殊部位疾病治疗等^{[ 25 ]} 。Dean等^{[ 26 ]}用电穿孔技术将报告基因导入小鼠肺瞬时表达的同时没有造成明显伤害。Kusumanto等^{[ 27 ]}通过体内实验对比发现,用电穿孔技术辅助质粒的肌肉注射转染效率比超声法高很多。现在已有一种微流体设备可对单个细胞进行电转,达到了很高的效率^{[ 28, 29 ]} 。