超声微气泡

1987年, Fechheimer等首先应用超声介导质粒DNA进入成纤维细胞,但转染效率很低。近年来,Taniyama等^{[ 30 ]}研究发现在超声和造影剂形成的微气泡的共同作用下,细胞膜会发生瞬时、可逆的穿孔,从而促进一些大分子物质进入胞内。微气泡和DNA的结合可使转染效率提高4～5倍^{[ 31 ]} 。

超声/微气泡转染法仅需少量的DNA,具有快速、经济、操作安全的优点,可用于体外和体内研究,因为是一种物理方法,应用的细胞和组织范围广泛。但该方法需要超声仪和一定的技术,且对细胞有一定的伤害。此外超声波强度、作用时间、脉冲频率、通断比以及微气泡外壳和核心气体成分、微气泡的大小和密度等因素都会对转染效率产生影响。
Yamashita等^{[ 32 ]}研究发现联合应用电穿孔和超声的转染效率高于单用其中任何一种。Suzuki等^{[ 33 ]}研究发现在体内实验中合用一种泡沫脂质体和超声的方法,转染效率可高于常规阳离子脂质体,随后,他们又报道了包含超声造影剂perfluorop ropane的一种新型脂质微泡^{[ 34 ]} ,直径比常规微泡更小,体内实验显示其在超声的作用下,可作为一种高效递送载体。

显微注射和基因枪

尽管将外源物质导入细胞的方法已经有很多种,但对于某些类型的细胞仍然束手无策。目前针对这种情况,应用显微注射或基因枪也许是最有效的。

显微注射就是使用一根超细针头将外源物质直接注入细胞质或细胞核。1911年Barber最先应用玻璃注射针头将物质导入植物细胞,随着技术的发展和研究的深入,显微注射针的设计更加精细复杂,并使可注射物质的种类更趋多样化,包括缓冲液分子、核酸、抗体和细胞器等等。最近出现了一种高通量自动化单细胞微注射的机器人, 1h可操作100个细胞,较人工操作快17倍,而效率接近^{[ 35 ]} 。Derouazi等^{[ 36 ]}用显微注射的方法建立了重组CHO 细胞系,效率高于磷酸钙转染。Akita等^{[ 37 ]}将可高效压缩DNA的多肽mu和SV40病毒T抗原核定位序列(NLS)融合,用于包裹压缩质粒DNA,通过显微注射进入细胞后发现转染效率显著提高。

20世纪80年代末,康奈尔大学的John Sanford和EdWolf及其同事发明了“基因枪”,用于外源基因导入植物细胞,而它现已用于动物细胞和体内实验。基因枪技术的原理是:将DNA结合上钨或金微粒,通过粒子加速系统进入细胞。目前2个主要的商业产品是Accell基因枪(Agracetus公司)和Helios基因枪(B ioRad实验室) 。基因枪的穿透深度较浅,主要针对皮肤,对深度组织不适用。Dileo 等^{[ 38 ]}报道了一种新型高压基因枪,可以到达皮下组织,如肌肉和肿瘤,并能长时表达。最近, L iana等^{[ 39 ]}报道了一种可以不用金属微粒作载体的基因枪转染方法。

显微注射和基因枪技术是一种纯物理方法,因此不受细胞类型的限制,但这2种方法需要的昂贵设备和相对复杂的技术限制了其普及应用。

其他

最近还出现了2种新的物理转染技术:激光照射和磁场转化法, 目前正处于初始研究阶段。Scherer等^{[ 40 ]}先将转染载体和磁微粒相连,再用PEI包裹,再借助外部磁场的作用将DNA转入细胞。运用该方法可以提高非病毒载体(如脂质体)和病毒载体(如腺病毒)的转染效率,并可用于体外和体内实验。Zeira等^{[ 41 ]}通过用一种红外激光照射,促进了裸DNA在肌肉组织的转染,其机制未明,可能与肌细胞膜的破坏有关。

展望

病毒感染法虽然具有很高的转染效率,但存在潜在、未知的危险性,使其应用受到诸多限制。因此,在基因递送载体和方法的研究中,人们越来越重视非病毒载体和方法的开发和优化。近年来出现了多种新载体和新方法以及老方法的改进,取得了不小的进步,相信随着科学技术的不断发展,非病毒基因递送技术将会在科学研究和医学治疗中发挥更大的作用。