2.2 竞争性DNA 杂交
在探针和靶基因设计上,竞争性杂交和直接杂交相同。但在竞争性DNA 杂交中需要构建一种荧光标记的竞争性寡核苷酸,其与偶联在微球表面的特异性捕获探针互补。竞争杂交时,非标记的双链PCR 扩增产物与标记的竞争性寡核苷酸与微球上的捕获探针竞争退火[6]。当不加样本(不含目标序列)时,可以在微球上检测最大的荧光强度;如果加入样本(含目标序列),目标序列会与荧光标记的互补寡核苷酸结合,从而降低了微球表面荧光强度,而且加入的目标序列的量和荧光强度的降低存在比例关系。当不可能或不方便通过PCR 或其他方法直接标记靶核酸时,就可使用这种分析模式。
2.3 液相化学反应结合微球捕获
在这种模式中,先以PCR 扩增出待检靶分子DNA,然后通过液相中的酶反应(碱基延伸反应或DNA 连接反应)向靶DNA 偶联特异性捕获序列,再与微球表面的互补寻址探针杂交后进行检测(图3)。这一分析模式对靶基因型的确定主要依赖于DNA 多聚酶和DNA 连接酶的分辨能力,包括等位基因特异性引物延伸(ASPE),寡核苷酸连接分析(OLA)和单碱基链延伸(SBCE)等3 种方法(图4)[7]。下面以SBCE 为例对基于溶液的微球捕获反应分析模式作较详细的说明[8]。
[注]靶DNA 经PCR 扩增,其中一个引物生物素化,扩增产物变性,
与等位基因特异性探针偶联的微球系统杂交,以链霉亲和素- R- 藻红
蛋白标记后检测
图2 微球依赖的竞争性杂交分析模式图
[注]左:不含靶DNA 时,生物素化的竞争性寡核苷酸与等位基因特
异性探针偶联的微球系统杂交,以链霉亲和素- R- 藻红蛋白标记后检
测,获得100%的荧光信号;右:存在靶DNA 时,生物素化的竞争性
寡核苷酸与靶DNA 杂交,而不与等位基因特异性探针偶联的微球系
统杂交。靶DNA/竞争性寡核苷酸杂交物以链霉亲和素- R- 藻红蛋白
标记,导致等位基因特异性探针偶联的微球系统荧光信号的降低。