液相芯片技术在核酸检测中的应用研究进展

www.yongyao.net　　2010-1-13 11:18:44　　来源：　　责任编辑：

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3.2 遗传性疾病扫描诊断

Colines 等使用直接杂交对新生儿血DNA 的β- 球蛋白变异体进行多通道基因分型^［14］。Dunbar 和Jacobson 对来自14 个特征性人DNA 样品的生物素化的DNA 进行多通道直接杂交，在囊性纤维化穿膜调节基因（CFTR）可精确检测5 个突变^［15］。Hadd 等使用3 通道的直接杂交分析，确定CFTR 基因的内含子8 的5T/7T/9T 的多态性^［16］。这一过程方便快捷，不需要纯化、清洗等步骤，容易操作，结果经DNA 测序证明正确。

多通道直接杂交还被用于分析与血栓形成倾向体质有关的基因突变。基于xMAP 的分析用于研究因子V 的506 R→Q 突变，因子II 的20210G→A 突变，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的677C→T 突变与静脉血栓栓塞风险增加的关系。最近Bortolin 等用多通道ASPE 法检测了上述及其他3 个和血栓形成倾向有关的突变：MTHFR 的1298C→T 突变，因子VIII的134 val→leu 突变，和组织因子途径抑制因子（TFPI）的536C→T 突变^［17］。总共对132 个患者DNA 样品进行基因分型，其结果与测序结果完全一致。

Wallace 等建立了一种BAR- CODE- ALL 微球点阵编码的急性淋巴细胞白血病分析法，用于检测在儿童淋巴细胞白血病中，由于染色体转位而产生的7 个融和转录子^［18］。在一个多通道反应中，所有的7 种突变都以100%的敏感性和特异性在6小时内被检测出来。

3.3 基因表达谱分析

Yang 等建立了BADGE （基因表达的微球点阵检测）分析法，用生物素化的cRNA 与偶联在微球上的互补捕获探针杂交，对拟南芥（Arabidopsis）中特定基因的表达进行定量^［19］。结果与由GeneChip 探针点阵所获的结果有可比性，敏感性足以检测到中等程度表达的基因（每细胞10~30 拷贝）。他们认为微点阵技术适用于对少数样品进行全基因组扫描，TaqMan技术适用于对大量样品的少量基因进行扫描，而BADGE 技术对较多的样品进行多达100 个基因的扫描则最为理想。

3.4 HLA DNA 分型

Fulton 等使用多通道竞争性杂交分析对HLA 等位基因进行分型^［6］。他们合成了16 个与HLA- DQA1 第2 个外显子内等位基因序列对应的寡核苷酸作为探针。与探针序列互补的标记寡核苷酸（竞争性寡核苷酸）先与未标记的双链模板预杂交，再与负载了与等位基因互补的探针的微球系统进行杂交，然后使用Luminex FlowMetrix 系统进行荧光分析，与不加标记竞争物时所获的荧光强度进行比较，确定出荧光的抑制率。对照模板对竞争寡核苷酸与其互补微球杂交的抑制在62%~93%之间，而对非互补微球杂交的抑制低于21%。

3.5 微生物检测

对病原微生物的分子检测广泛应用于公共卫生，水质监控和食品工业等领域，xMAP 技术可用于检测细菌，病毒和真菌等病原体。Smith 等建立了一种检测病毒核酸的多通道分析方法，即同时扩增HIV、HCV 和HSV 的内部扩增对照与病毒序列，并与负载了针对每一种病毒序列和对照序列的捕获探针的微球系统直接杂交^［20］。结果具有高度特异性，能够对3 个数量级范围内的核酸定量。

Spiro 等建立了对环境PCR 产物中的细菌DNA 进行多通道定量鉴定的方法，即用4 种细菌的16S/23S 核糖体DNA （rDNA）的基因内间隔区作为株系鉴定标志，获得极好的序列分辨^［21］。他们对从污染地下水中收集的微生物的16S rDNA 靶序列的丰度进行多通道定量分析，仅占总DNA0.3%的靶序列可被定量。

Ye 等用多通道ASPE 或SBCE 的SNP 基因分型方法鉴定17 种不同的革兰阴性或革兰阳性细菌的可变的16S rDNA序列^［22］。两种方法获得的结果都和直接测序一致。

Dunbar SA 等用直接杂交法对和食品病原性疾病有关的细菌病原体进行多通道定量检测^［23］。他们设计通用引物，扩增含有能特异性区分E.coli、Salmonella、L.monocytogenes 和C.jejuni的序列中23S rDNA 的一个区域。这一方法能准确和特异性地鉴别每种细菌，能检测107~108 拷贝的扩增靶分子，相当于PCR 反应中103 E.coli、Salmonella 和L.monocytogenes 和105 C.jejuni 的基因组拷贝。

Diaz 和Fell 等用直接杂交法高通量检测毛孢子菌属（Trichosporon）^［24］。这一方法使用48 种针对rDNA 的D1 /D2 区、基因内转录的Spacer 区域的和基因间的Spacer 区的种特异性和群特异性捕获探针，每种都负载在一个特异性微球上。用3对引物同时扩增上述3 个区域的片段，随后与负载探针的微球杂交，以多通道的方式检测。这一方法快速特异，能通过一个核苷酸辨别不同菌种，在扩增后只需要不到50 min 就可获得结果。这一方法能检测到107~108 拷贝的扩增产物，相当于PCR 反应中102 基因组拷贝。

4 结语

人类基因组测序已经完成，丰富的信息加深了我们对基因差异及其与疾病和疾病治疗关系的理解。越来越多的致病基因突变需要鉴定，分子生物学实验室要检测的DNA 大幅度增加，迫切需要快速，精确，经济的高通量核酸检测方法。研究表明xMAP 平台能充分满足这一需求。随着商业化试剂盒的开发，在实验室开展依赖xMAP 技术的核酸检测变得更容易，应用也更加广泛。可以预见，xMAP 技术在核酸定量检测和基因表达谱分析等领域具有广阔的应用前景。