[注]A.进行液相酶反应,向产物偶联唯一的捕获序列;B.寻址探针偶
联的微球系统;C.通过捕获序列和寻址探针的杂交使产物捕获于微球
系统,以链霉亲和素- R- 藻红蛋白标记后检测
(1)PCR 扩增:以待检样品的基因组为模板,以引物扩增出含有SNP 或突变的待检DNA 片断。
(2)以SAP (虾碱性磷酸酶)、ExoI (核酸外切酶I)处理PCR 扩增产物,降解PCR 引物和dNTP,然后热灭活Taq 酶。
(3)SBCE 反应:反应体系包括:Tris- HCl,MgCl2,Taq酶,模板(含有SNP 位点的双链PCR 产物),每一等位基因特异性的荧光素FITC 标记的ddNTP,其他3 种ddNTP,偶联了捕获探针的引物。针对每个SNP 位点,设计具有唯一序列的捕获探针,用于分析一对等位基因。针对不同的SNP,使用不同的捕获序列,可以进行多通道SNP 分析。
(4)与微球杂交:SBCE 完成后,加入负载了与捕获探针互补的寻址探针和通用荧光素酶序列(SeqLUC)的微球,与SBCE 产物杂交。
(5)流式细胞仪分析。
在SBCE 中,引物的3’端定位于SNP 或突变上游1 个核苷酸处,而在ASPE 和OLA,引物的3’端恰与SNP 或突变位点对应。在ASPE 中,通过加入dNTPs (其中一个用生物素标记),以热稳定性多聚酶用于延伸引物。只有引物的3’端核苷酸与模板互补并退火到模板DNA 上时,延伸才能发生。在OLA 中,当一个生物素标记的寡核苷酸(报告探针)与SNP或突变的下游序列互补时,使用热稳定的连接酶,能将标记的报告探针连接在引物上。探针的5’端磷酸化,为连接酶提供底物,3’端以生物素标记,用于荧光素检测。
液相化学反应结合微球捕获的分析模式通过在酶反应步骤向等位基因特异性引物偶联合适的捕获序列,使得可寻址的微球系统能用于多种不同的分析,可以确定不同的靶序列。
3 应用
3.1 SNP 基因分型
SNP 是人类基因组中最广泛的序列变化,为鉴定疾病提供了特异性位点,也是预测疾病和药物敏感性的重要标志。直接杂交法和OLA、SBCE 以及ASPE 法都被广泛用于SNP 基因分型。
Armstrong 等建立了一种32 通道的直接杂交SNP 基因分型技术,能同时确定8 个不同多态性基因的基因型[9]。针对每种多态性设计4 种不同的等位基因特异性寡核苷酸(ASO),每一个ASO 在多态性位点含有一个不同的碱基。当荧光素标记的PCR 产物与ASO 完全互补时直接杂交,并被捕获在负载ASO 的微球上。使用Luminex : FlowMetrix TM 系统通过流式细胞术分析反应,通过信噪比分析来确定基因分型,荧光信号最强的微球代表靶DNA 的基因型。结果与TaqMan 所获的结果进行比较,对39 个基因型的检测完全正确。
Iannone 等使用OLA 法对来自7 个DNA 样品的、定位在ApoE 位点附近的9 个SNPs 进行基因分型[10]。他们比较了18通道和单通道分析的结果,发现在多通道分析中并没有损失荧光信号,认为多通道分析具有高通量、快速、精确和反应试剂使用充分等优点。